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Omega-質粒提取試劑盒

操作步驟： 

使(shi)用(yong)前請先在漂(piao)洗液中加入(ru)無水乙醇，加入(ru)體積請參(can)照瓶上的(de)標(biao)簽。溶液YP1在使(shi)用(yong)前先加入(ru)RNaseA（將試劑盒中提(ti)供的(de) RNaseA全部加入(ru)），混勻，置(zhi)于(yu) 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均(jun)為使(shi)用(yong)臺式

離(li)心機在室溫(wen)下離(li)心。 

1、取1-5ml酵(jiao)母培養物（不(bu)超(chao)過 5×107cells），12000rpm離(li)心 1min，盡量吸除上(shang)清（菌(jun)液較多時可以通過多次離(li)心將菌(jun)體沉淀收集到一(yi)個離(li)心管中）。 

2、酵母細胞壁的破除： 

A、酶法：向(xiang)酵母(mu)菌體中加(jia)入(ru)(ru) 470ul 山梨醇(chun) Buffer，充(chong)分(fen)懸浮菌體，加(jia)入(ru)(ru) 25ul 酵母(mu)破(po)壁酶和(he) 5ul β-巰基(ji)乙醇(chun)，充(chong)分(fen)混勻(yun)，30℃處(chu)理(li) 1-2h，期間(jian)可顛倒離(li)心(xin)管(guan)混勻(yun)數次。12000rpm 離(li)心(xin) 1min，棄上清，收集沉淀。向(xiang)沉淀中加(jia)入(ru)(ru) 250ul 溶液 YP1（請先檢查(cha)是(shi)否(fou)已(yi)加(jia)入(ru)(ru) RNaseA） ，充(chong)分(fen)懸浮沉淀。注意：如果菌塊未*混勻(yun)，會影響裂解導致質(zhi)粒提取量和(he)純度偏低(di)。 

B、玻(bo)璃(li)珠(zhu)法：向酵(jiao)母菌體中加入(ru) 250ul 溶液(ye) YP1（請(qing)先(xian)檢查是否已加入(ru) RNaseA） ，充分(fen)懸浮沉淀。加入(ru) 150-200ul酸洗玻(bo)璃(li)珠(zhu)（自備），漩渦振蕩 10min。簡短(duan)離心使玻(bo)璃(li)珠(zhu)沉降到離心管(guan)底，吸取上(shang)清(qing)（如上(shang)清(qing)有所(suo)損失(shi)，請(qing)用溶液(ye) YP1 補足 250ul）于另一干凈(jing)離心管(guan)中。 

3、向離(li)心(xin)管中加(jia)入 250ul溶(rong)液 YP2，溫和(he)地上下翻轉 6-8 次使菌體充(chong)分裂解。注意：混勻一定要溫和(he)，以

免污(wu)染細(xi)菌基因(yin)組(zu) DNA，此時(shi)菌液(ye)應變(bian)得清亮粘稠，作用時(shi)間不要(yao)超(chao)過 5 min，以免質粒受到破壞。 

4、向離(li)心管中(zhong)加入(ru) 350ul溶液 YP3，立即溫和地上(shang)下翻轉 6-8次(ci)，充分混勻(yun)，此(ci)時會(hui)出現白(bai)色絮狀沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)。12000rpm離(li)心 10 min，用移液器小(xiao)心地將(jiang)上(shang)清轉移到(dao)另一個干凈的離(li)心管中(zhong)，盡量(liang)不要吸出沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)。注(zhu)意：溶液 YP3 加入(ru)后(hou)應(ying)立即混合，避(bi)免產(chan)生(sheng)局部沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)。如果上(shang)清中(zhong)還有(you)微小(xiao)白(bai)色沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)，可再次(ci)離(li)心后(hou)取上(shang)清。 

5、將上(shang)(shang)一步所得上(shang)(shang)清液(ye)加(jia)入(ru)吸附柱中(zhong)(zhong)，室溫放(fang)置 2min，12000rpm 離心(xin) 1min，倒(dao)掉收(shou)集(ji)管中(zhong)(zhong)的廢液(ye)，吸附柱重新(xin)放(fang)回(hui)收(shou)集(ji)管中(zhong)(zhong)。 

6、向吸附柱(zhu)中加入(ru) 700ul 漂洗液(ye)(使用前請先檢查是否已加入(ru)無(wu)水乙醇)，12000rpm 離(li)心 1min，棄(qi)廢液(ye)，將吸附柱(zhu)放入(ru)收集管中。 

7、向(xiang)吸(xi)附柱中加入 500ul漂洗液，12000rpm離心 1min，棄廢液，將吸(xi)附柱放入收(shou)集管中。 

8、12000rpm 離心 2min，將(jiang)吸附(fu)柱(zhu)敞口置于室溫(wen)或(huo) 50℃溫(wen)箱放置數(shu)分鐘，目(mu)的(de)是將(jiang)吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)殘(can)余的(de)漂洗液去除，否則漂洗液中(zhong)的(de)乙醇會影(ying)響(xiang)后續的(de)實驗如(ru)酶切、PCR 等。 

9、將吸附(fu)柱放入一個干凈的(de)離心管(guan)中(zhong)，向吸附(fu)膜中(zhong)央(yang)懸空滴加 50-200ul 經 65℃水浴預熱的(de)洗脫(tuo)液，室(shi)溫放置 2min，12000rpm離心 1min。 

10、為了(le)增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫(tuo)液重新(xin)加入吸(xi)附柱中，室溫放置 2min， 12000rpm離心(xin) 1min。  

注意事(shi)項(xiang)： 

1、使用前請先檢查溶(rong)液(ye) YP2 和溶(rong)液(ye) YP3 是否出現混(hun)濁(zhuo)，如有混(hun)濁(zhuo)現象，可在(zai) 37℃水浴中加熱幾分(fen)鐘(zhong)，待溶(rong)液(ye)恢復澄清后(hou)再使用。 

2、洗(xi)脫(tuo)緩沖液(ye)體積(ji)不應少(shao)于(yu) 50ul，體積(ji)過小影響(xiang)回收效率；洗(xi)脫(tuo)液(ye)的 pH值對(dui)洗(xi)脫(tuo)效率也有影響(xiang)，若需要用水(shui)做洗(xi)脫(tuo)液(ye)應保證其 pH 值在(zai) 8.0 左右(you)(可用 NaOH 將水(shui)的 pH 值調此(ci)范圍(wei))，pH 值低于(yu) 7.0 會降(jiang)低。洗(xi)脫(tuo)效率；DNA產物應保存在(zai)-20℃，以防 DNA降(jiang)解。 

3、質(zhi)粒(li)得率與酵母菌株、質(zhi)粒(li)拷貝數、培養(yang)條(tiao)件(jian)等(deng)因素有關(guan)。通(tong)(tong)常酵母質(zhi)粒(li)拷貝數都(dou)很低(di)，一般通(tong)(tong)過(guo)電(dian)泳或分光光度計法都(dou)很難檢測到，可(ke)通(tong)(tong)過(guo) PCR或轉化大(da)腸桿菌來檢測。 

4、DNA濃(nong)度及(ji)純度檢測：得到(dao)的(de)基因組DN**段的(de)大(da)小與樣品保存時(shi)(shi)間、操作過程(cheng)中的(de)剪切(qie)力(li)等因素(su)有(you)關。回收(shou)得到(dao)的(de)DN**段可用(yong)瓊脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳和(he)紫外(wai)分光光度計檢測濃(nong)度與純度。DNA應(ying)在OD260處有(you)顯著吸收(shou)峰， OD260值(zhi)為 1 相當于大(da)約 50  μg/ml雙鏈(lian)DNA、40  μg/ml單鏈(lian)DNA。OD260/OD280比值(zhi)應(ying)為1.7-1.9，如果洗脫時(shi)(shi)不使用(yong)洗脫緩沖液，而(er)使用(yong)去(qu)離子水(shui)，比值(zhi)會偏低，因為pH值(zhi)和(he)離子存在會影響光吸收(shou)值(zhi)，但并不表示純度低。 

Omega-質粒提取試劑盒