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Human IL-8人白細胞介素8ELISA試劑盒
產品編號：SEKH-0016
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

背景介紹：
      白(bai)(bai)細(xi)胞(bao)(bao)介素 8(IL-8)為趨化(hua)(hua)因(yin)子超家族(zu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)一(yi)員。人類(lei) IL-8 的(de)(de)(de)(de) cDNA 序列含(han) 99 個氨基(ji)酸殘基(ji)，含(han) 4 個 Cys，無 N 糖基(ji)化(hua)(hua)位點(dian)，IP8.0～8.5，分子量為 8.3kD，耐(nai)(nai)熱、耐(nai)(nai)堿、耐(nai)(nai)胰蛋(dan)白(bai)(bai)酶，但對(dui)巰基(ji)化(hua)(hua)合(he)物(wu)敏感。單 核細(xi)胞(bao)(bao)、巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)、內皮細(xi)胞(bao)(bao)、多形核白(bai)(bai)細(xi)胞(bao)(bao)(PMN)、成纖維細(xi)胞(bao)(bao)、Ⅰ型上皮細(xi)胞(bao)(bao)及(ji)支(zhi)氣管上皮細(xi)胞(bao)(bao)等均(jun)能(neng) 產(chan)生 IL-8，在肺部可能(neng)以巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)為主。IL-8 是由(you)單核/巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)產(chan)生的(de)(de)(de)(de)單核因(yin)子，對(dui)中(zhong)性(xing)粒細(xi)胞(bao)(bao)、T 淋巴 細(xi)胞(bao)(bao)、嗜堿性(xing)粒細(xi)胞(bao)(bao)具(ju)有趨化(hua)(hua)作(zuo)用(yong)，能(neng)夠調節(jie) T、B 淋巴細(xi)胞(bao)(bao)成熟分化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)激(ji)素樣分子，在炎癥反應、免疫調 節(jie)中(zhong)起重(zhong)要作(zuo)用(yong)。

Human IL-8人白細胞介素8ELISA試劑盒

檢測原理：
      Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑(ji)(ji)盒采(cai)用(yong)基(ji)于(yu)雙抗(kang)體(ti)夾心(xin)法的(de)(de)(de)酶(mei)聯(lian)免疫吸(xi)附(fu)檢(jian)測技術。將(jiang)抗(kang)人(ren) IL-8 單(dan)克隆抗(kang)體(ti)包被在(zai)酶(mei)標板(ban)(ban)上；分(fen)別加入(ru)(ru)梯度(du)稀釋的(de)(de)(de)標準品(pin)和(he)(he)(he)預稀釋的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)，標準品(pin)和(he)(he)(he)樣(yang)本(ben)(ben)中的(de)(de)(de)人(ren) IL-8 會(hui)(hui)與酶(mei)標 板(ban)(ban)上的(de)(de)(de)包被抗(kang)體(ti)充(chong)分(fen)結(jie)合(he)；洗(xi)板(ban)(ban)后(hou)(hou)加入(ru)(ru)生(sheng)(sheng)物素(su)化(hua)(hua)抗(kang)人(ren) IL-8 抗(kang)體(ti)，該(gai)抗(kang)體(ti)會(hui)(hui)與板(ban)(ban)子上包被抗(kang)體(ti)捕獲的(de)(de)(de)標準品(pin) 和(he)(he)(he)樣(yang)本(ben)(ben)中的(de)(de)(de)人(ren) IL-8 發生(sheng)(sheng)特異性結(jie)合(he)；洗(xi)板(ban)(ban)后(hou)(hou)加入(ru)(ru)辣根過(guo)氧化(hua)(hua)物酶(mei)（HRP）標記(ji)的(de)(de)(de)鏈(lian)霉親和(he)(he)(he)素(su)，生(sheng)(sheng)物素(su)與鏈(lian) 霉親和(he)(he)(he)素(su)會(hui)(hui)發生(sheng)(sheng)高強(qiang)度(du)的(de)(de)(de)非共價結(jie)合(he)；洗(xi)板(ban)(ban)后(hou)(hou)加入(ru)(ru)顯色劑(ji)(ji)底物 TMB，若反(fan)(fan)應孔中樣(yang)品(pin)存在(zai)不(bu)同濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)人(ren) IL-8， 則(ze) HRP 會(hui)(hui)使(shi)無色 TMB 變成(cheng)不(bu)同深淺（正(zheng)相關）的(de)(de)(de)藍色物質(zhi)，加入(ru)(ru)終止(zhi)液后(hou)(hou)反(fan)(fan)應孔會(hui)(hui)變成(cheng)黃色；后(hou)(hou)，在(zai) λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定(ding)反(fan)(fan)應孔樣(yang)品(pin)吸(xi)光度(du)（OD），樣(yang)本(ben)(ben)中的(de)(de)(de)人(ren) IL-8 濃(nong)度(du)與 OD 成(cheng)正(zheng)比，通過(guo) 繪制標準曲線(xian)和(he)(he)(he)四參數擬合(he)軟件(jian)便可計算(suan)出樣(yang)本(ben)(ben)中人(ren) IL-8 的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免交叉污(wu)染(ran)，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔(jie)凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果準(zhun)確，每次(ci)檢測(ce)均需做標準(zhun)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護(hu)有關管理規(gui)定執行。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管(guan)

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準(zhun)品的值，請將樣品做適當倍數稀釋(shi)后(hou)檢(jian)測，建議正式實驗前(qian)做預實驗以確定稀釋(shi)倍數。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)梯度(du)(du)稀(xi)釋(shi)(shi)：加(jia)入(ru)(ru)(ru)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)/樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)(shi)液（SR1）1ml凍干標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)中(zhong)，靜置(zhi)15分鐘待其*溶解后(hou)輕(qing) 輕(qing)混勻(濃度(du)(du)為(wei)1000pg/ml)，然后(hou)在(zai)濃度(du)(du)為(wei)400pg/ml的(de)(de)EP管中(zhong)加(jia)入(ru)(ru)(ru)600?1?71?1?778?1?71?1?776L標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)/樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)(shi)液（SR1），再 加(jia)入(ru)(ru)(ru)400?1?71?1?778?1?71?1?776L 1000pg/ml標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)原液，以(yi)獲(huo)得標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)曲線(xian)的(de)(de)濃度(du)(du)400pg/ml。后(hou)，在(zai)其余六管中(zhong)各加(jia)入(ru)(ru)(ru) 500?1?71?1?778?1?71?1?776L標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)/樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)(shi)液（SR1），按(an)照(zhao)以(yi)下(xia)濃度(du)(du)進(jin)(jin)行2倍(bei)稀(xi)釋(shi)(shi)：200、100、50、25、12.5、6.25pg/ml 進(jin)(jin)行稀(xi)釋(shi)(shi)。標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)/樣本(ben)(ben)稀(xi)釋(shi)(shi)液（SR1）作為(wei)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)曲線(xian)的(de)(de)零點(dian)（0pg/ml）。復溶過的(de)(de)標(biao)(biao)(biao)(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)原液（1000pg/ml） 未用完的(de)(de)應廢棄或根據需要按(an)照(zhao)一(yi)次用量分裝，并將其貯存在(zai)-20～-80℃冰箱，具體如下(xia)圖。

4. 生(sheng)物素化(hua)抗體(ti)工作液：預先計(ji)算好試驗所(suo)需用(yong)量(liang)，用(yong)檢測稀(xi)釋液（SR2）將100倍抗體(ti)濃縮液稀(xi)釋成1倍

應用工作液(ye)（稀釋前充分混勻），請(qing)在30分鐘(zhong)內加入到反(fan)應孔中。

5. 酶結合(he)物工作液：按(an)每次試驗所需用(yong)量配制(zhi)，用(yong)酶結合(he)物稀釋(shi)(shi)液（SR3）將100倍濃縮酶結合(he)物稀釋(shi)(shi)成1 倍應用(yong)工作液（稀釋(shi)(shi)前離心），請在30分(fen)鐘內使用(yong)。

6. 洗滌方法： 

自動洗(xi)板：甩盡酶(mei)標板孔中液體，在厚(hou)迭吸水紙上拍干，注入(ru)洗(xi)滌(di)液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗(xi)板 5 次。 

手(shou)工洗(xi)(xi)板：甩盡(jin)酶標(biao)板孔(kong)中(zhong)液(ye)體(ti)，在厚(hou)迭吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)干，用洗(xi)(xi)瓶加(jia)入洗(xi)(xi)滌液(ye) 300ul/孔(kong)，靜止 30 秒后甩 凈(jing)酶標(biao)板孔(kong)中(zhong)液(ye)體(ti)，在厚(hou)迭的吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)干，洗(xi)(xi)板 5 次。

結果判斷：

1.用(yong)酶標儀 450 nm 波長測(ce)(ce)定(ding) OD 值(zhi)(zhi)。選(xuan)擇(ze)雙(shuang)波長檢(jian)測(ce)(ce)，參考波長為 630 nm。如不能(neng)進行(xing)雙(shuang)波長檢(jian)測(ce)(ce)，請 用(yong) 450 nm 的 OD 測(ce)(ce)定(ding)值(zhi)(zhi)減(jian)去 630 nm 的 OD 測(ce)(ce)定(ding)值(zhi)(zhi)。

2.計算標(biao)準品(pin)、樣品(pin)的平均 OD 值(zhi)：每(mei)個標(biao)準品(pin)和標(biao)本的 OD 值(zhi)應減去(qu)零孔的 OD 值(zhi)

3.以標(biao)準品(pin)(pin)濃度(du)(du)為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，吸光度(du)(du)OD值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，用軟件繪(hui)制標(biao)準曲線，樣品(pin)(pin)中IL-8含量可通過對應OD 值由(you)標(biao)準曲線換算出相應的濃度(du)(du)。

4.若標本 OD 值(zhi)高于標準曲線上(shang)限，應做適(shi)當稀釋后重新檢測，計算(suan)濃(nong)度(du)時再乘以稀釋倍數。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-8 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-8濃度達 3pg/ml，
20 個零(ling)標準品濃度(du) OD 的平(ping)均值加上兩個標準差，計算相應的可(ke)檢測濃度(du)。

3. 特異性：
不(bu)與人 GROα、GROβ、IP-10、MIP-1α、MCP-1、RANTES 反應，小鼠 KC、MIG、SDF-1 等反應。

4. 重復性：
板(ban)(ban)內，板(ban)(ban)間變異系(xi)數<10%。

5. 回收率：
在選取的(de)健康人(ren)血漿、細胞培養上清中加入 3 個(ge)不同濃(nong)度水平的(de)人(ren) IL-8，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分(fen)別在(zai)選取的 4 份健康(kang)人血漿(jiang)和細胞培養上清中加(jia)入(ru)高濃(nong)度人 IL-8，在(zai)標準曲線動力(li)學(xue)范圍內(nei)進行稀 釋，評估(gu)線性。