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人白細胞介素5ELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0012
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

Human IL-5 ELISA KIT

Human IL-5 ELISA KIT

背景介紹：
      人(ren)IL-5由(you)(you)抗原活化(hua)(hua)的(de)(de)(de) CD4+T 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)產生，在小鼠則由(you)(you)Th2亞群(qun)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)產生。天然IL-5的(de)(de)(de)分子量(liang)為40~50KD， 是(shi)由(you)(you)二硫(liu)鍵連接的(de)(de)(de)二聚體(ti)糖蛋(dan)白，但是(shi)單體(ti) IL-5 也有(you)(you) IL-5 活性。人(ren)的(de)(de)(de) IL-5 由(you)(you) 134 氨(an)基(ji)酸殘基(ji)組成(cheng)，含 22 氨(an)基(ji)酸殘基(ji)信(xin)號(hao)肽，2 個糖基(ji)化(hua)(hua)點，人(ren)和(he)(he)小鼠 IL-5 基(ji)因分別定位于第 5 號(hao)和(he)(he)第 11 號(hao)染色體(ti)，人(ren)和(he)(he)鼠 IL-5 在 氨(an)基(ji)酸水平上有(you)(you) 70％的(de)(de)(de)同(tong)源性，人(ren)和(he)(he)鼠 IL-5Rα鏈有(you)(you) 79％的(de)(de)(de)同(tong)源性。IL-5 主(zhu)要(yao)有(you)(you)促(cu)進(jin) B 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)(hua)與(yu)生長;誘(you) 導(dao)嗜酸性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)(hua);促(cu)進(jin) IgA 合成(cheng);誘(you)導(dao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒(du) T 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(CTL)的(de)(de)(de)生成(cheng)以(yi)及(ji)刺(ci)激嗜酸性粒細(xi)胞(bao)(bao)(bao)增殖、分化(hua)(hua)及(ji)活 化(hua)(hua)等作用。

檢測原理：
     Solarbio  ELISA 試劑(ji)盒采用基于雙抗(kang)體夾(jia)心(xin)法的(de)(de)酶聯免疫吸附檢測(ce)(ce)技術。將抗(kang)人(ren)(ren) IL-5 單克 隆抗(kang)體包被在酶標(biao)板(ban)(ban)上；分(fen)別加(jia)入(ru)梯度(du)稀釋的(de)(de)標(biao)準品(pin)和(he)預稀釋的(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)，標(biao)準品(pin)和(he)樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 會與酶標(biao) 板(ban)(ban)上的(de)(de)包被抗(kang)體充分(fen)結(jie)(jie)合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入(ru)生物(wu)素化(hua)抗(kang)人(ren)(ren) IL-5 抗(kang)體，該抗(kang)體會與板(ban)(ban)子上包被抗(kang)體捕獲的(de)(de)標(biao)準品(pin) 和(he)樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 發生特異性結(jie)(jie)合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入(ru)辣根過(guo)氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標(biao)記的(de)(de)鏈(lian)霉(mei)親(qin)和(he)素，生物(wu)素與鏈(lian) 霉(mei)親(qin)和(he)素會發生高強度(du)的(de)(de)非共(gong)價結(jie)(jie)合(he)；洗板(ban)(ban)后加(jia)入(ru)顯色(se)(se)劑(ji)底物(wu) TMB，若反應(ying)孔中樣(yang)(yang)品(pin)存在不(bu)同濃(nong)(nong)度(du)的(de)(de)人(ren)(ren) IL-5， 則 HRP 會使無(wu)色(se)(se) TMB 變成不(bu)同深淺（正(zheng)相關(guan)）的(de)(de)藍色(se)(se)物(wu)質(zhi)，加(jia)入(ru)終止液(ye)后反應(ying)孔會變成黃色(se)(se)；后，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(ce)(ce)定反應(ying)孔樣(yang)(yang)品(pin)吸光度(du)（OD），樣(yang)(yang)本(ben)中的(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 濃(nong)(nong)度(du)與 OD 成正(zheng)比，通過(guo) 繪制標(biao)準曲線和(he)四參(can)數擬(ni)合(he)軟件便可計算出樣(yang)(yang)本(ben)中人(ren)(ren) IL-5 的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免交叉污染，請在試(shi)驗中(zhong)使用 1 次性試(shi)管，槍頭，封板膜(mo)（※）及潔凈(jing)塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果(guo)準確(que)，每次(ci)檢測均(jun)需做標準曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗(yan)室安全防護有關管(guan)理(li)規定執(zhi)行(xing)。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯(xi)試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準品的(de)值，請將樣品做(zuo)適當(dang)倍數稀釋(shi)后檢測，建議正式實驗前做(zuo)預實驗以確定稀釋(shi)倍數。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)梯度(du)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)：加(jia)入(ru)(ru)標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1）1ml凍(dong)干標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)中(zhong)，靜置15分(fen)鐘待其*溶解(jie)(jie)后輕 輕混勻(濃(nong)度(du)為(wei)(wei)2000pg/ml)，然后在其余七管中(zhong)各加(jia)入(ru)(ru)500?1?78?1?76L標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1），按(an)照(zhao)以(yi)下濃(nong)度(du) 進行2倍稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)：300（標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)700ul+溶解(jie)(jie)好的標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)原液(ye)300ul）、150、75、37.5、18.75、9.375、 4.68、0 pg/ml進行稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)。300pg/ml為(wei)(wei)標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)曲(qu)線點濃(nong)度(du)，標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)/樣本(ben)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)（SR1）作為(wei)(wei)標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)曲(qu)線的 零點（0pg/ml）。復溶過(guo)的標(biao)準(zhun)(zhun)(zhun)品(pin)(pin)原液(ye)（2000pg/ml）未(wei)用(yong)完的應廢棄或根據(ju)需要(yao)按(an)照(zhao)一次用(yong)量分(fen)裝，并 將其貯存在-20～-80℃冰箱，具(ju)體如下圖。

4. 生(sheng)物(wu)素(su)化(hua)抗(kang)體工作(zuo)液：預先計算(suan)好試驗所需用(yong)量(liang)，用(yong)檢測(ce)稀釋(shi)液（SR2）將100倍(bei)抗(kang)體濃縮液稀釋(shi)成1倍(bei)

應用(yong)工作液（稀釋(shi)前(qian)充分(fen)(fen)混勻），請在(zai)30分(fen)(fen)鐘(zhong)內加(jia)入(ru)到反應孔中。

5. 酶結合物(wu)工(gong)作液(ye)：按每次試驗所需用(yong)量配制，用(yong)酶結合物(wu)稀釋液(ye)（SR3）將100倍濃縮酶結合物(wu)稀釋成1 倍應用(yong)工(gong)作液(ye)（稀釋前離心），請在30分(fen)鐘內使用(yong)。

6. 洗(xi)滌方法： 

自動洗(xi)(xi)板(ban)：甩盡(jin)酶標板(ban)孔(kong)中液體，在厚迭(die)吸水紙上拍干，注(zhu)入洗(xi)(xi)滌液為(wei) 300ul/孔(kong),注(zhu) 與(yu)吸出間隔為(wei) 30 秒，洗(xi)(xi)板(ban) 5 次。 

手工洗(xi)板(ban)：甩(shuai)盡酶(mei)標(biao)板(ban)孔中液(ye)(ye)體，在厚迭吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍干，用洗(xi)瓶加入洗(xi)滌液(ye)(ye) 300ul/孔，靜止 30 秒后甩(shuai) 凈酶(mei)標(biao)板(ban)孔中液(ye)(ye)體，在厚迭的吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍干，洗(xi)板(ban) 5 次。

結果判斷：

1.用酶標(biao)儀 450 nm 波長(chang)(chang)測定(ding) OD 值。選(xuan)擇(ze)雙(shuang)波長(chang)(chang)檢(jian)測，參(can)考波長(chang)(chang)為 630 nm。如不能進行雙(shuang)波長(chang)(chang)檢(jian)測，請 用 450 nm 的(de) OD 測定(ding)值減去 630 nm 的(de) OD 測定(ding)值。

2.計算標(biao)準(zhun)(zhun)品、樣(yang)品的平均 OD 值(zhi)：每個(ge)標(biao)準(zhun)(zhun)品和標(biao)本的 OD 值(zhi)應減(jian)去零孔的 OD 值(zhi)

3.以(yi)標(biao)準品(pin)濃度為橫(heng)坐標(biao)，吸光度OD值為縱坐標(biao)，用軟件繪制標(biao)準曲(qu)線，樣品(pin)中IL-5含量可通(tong)過對應OD 值由標(biao)準曲(qu)線換算出相(xiang)應的濃度。

4.若標(biao)(biao)本 OD 值高于(yu)標(biao)(biao)準(zhun)曲線上限，應(ying)做適當(dang)稀(xi)釋后重(zhong)新檢測，計算濃(nong)度(du)時(shi)再乘以稀(xi)釋倍數(shu)。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-5 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-5 濃度達 2pg/ml，
20 個零標準(zhun)品濃(nong)度(du) OD 的(de)(de)平均值加(jia)上兩(liang)個標準(zhun)差，計算相應的(de)(de)可檢(jian)測(ce)濃(nong)度(du)。

3. 特異性：
不(bu)與人 IL-3、IL-5 Rα、IL-5 Rβ反應(ying)，小鼠 IL-5 等反應(ying)。

4. 重復性：
板(ban)內，板(ban)間變異系數<10%。

5. 回收率：
在(zai)選取的健康(kang)人(ren)血漿、細胞培養上清中加(jia)入 3 個(ge)不同濃(nong)度水(shui)平(ping)的人(ren) IL-5，計(ji)算回收率。

6. 線性稀釋：

分(fen)別(bie)在選取的 4 份健康人(ren)血(xue)漿(jiang)和細胞培養上清中加入高濃度人(ren) IL-5，在標準曲線動力學范圍(wei)內進行稀 釋，評估線性。