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人白細胞介素5  Human IL-5 elisa

索萊寶ELISA試劑盒的優勢：
1，包被的酶標板單板可拆（能拆分成12個8孔的酶標條）
2，提供免費代測代檢服務，代出實驗數據
3，發文章高獎勵
4，磁(ci)鐵(tie)可(ke)吸附(fu)式包裝(zhuang)盒，包裝(zhuang)精美耐用(yong)

人白細胞介素5  人白細胞介素5 

人白細胞介素5ELISA 試劑盒
產品編號：SEKH-0012
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本

Human IL-5 elisa

背景介紹：
      人(ren)IL-5由(you)(you)抗原(yuan)活化(hua)(hua)(hua)的 CD4+T 細胞(bao)產(chan)生(sheng)(sheng)，在小鼠(shu)(shu)則由(you)(you)Th2亞群細胞(bao)產(chan)生(sheng)(sheng)。天(tian)然IL-5的分子量為40~50KD， 是由(you)(you)二硫(liu)鍵連接的二聚體糖蛋白，但(dan)是單體 IL-5 也有 IL-5 活性(xing)。人(ren)的 IL-5 由(you)(you) 134 氨(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)組成(cheng)，含 22 氨(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)信號肽，2 個糖基(ji)化(hua)(hua)(hua)點，人(ren)和(he)小鼠(shu)(shu) IL-5 基(ji)因分別(bie)定位于第(di)(di) 5 號和(he)第(di)(di) 11 號染色(se)體，人(ren)和(he)鼠(shu)(shu) IL-5 在 氨(an)基(ji)酸(suan)水平上有 70％的同源(yuan)性(xing)，人(ren)和(he)鼠(shu)(shu) IL-5Rα鏈有 79％的同源(yuan)性(xing)。IL-5 主要有促進 B 細胞(bao)分化(hua)(hua)(hua)與生(sheng)(sheng)長;誘 導(dao)嗜酸(suan)性(xing)粒(li)細胞(bao)分化(hua)(hua)(hua);促進 IgA 合成(cheng);誘導(dao)細胞(bao)毒 T 細胞(bao)(CTL)的生(sheng)(sheng)成(cheng)以(yi)及刺激嗜酸(suan)性(xing)粒(li)細胞(bao)增殖、分化(hua)(hua)(hua)及活 化(hua)(hua)(hua)等作用(yong)。

檢測原理：
     Solarbio  ELISA 試劑(ji)盒采用基(ji)于雙抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體夾心法的(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)聯免(mian)疫吸附檢測技術。將抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)人(ren)(ren) IL-5 單克 隆(long)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體包被(bei)(bei)在(zai)酶(mei)(mei)標(biao)板上(shang)；分別加(jia)入(ru)梯度(du)(du)稀(xi)釋(shi)的(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)和預稀(xi)釋(shi)的(de)(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)，標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)(pin)和樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 會與酶(mei)(mei)標(biao) 板上(shang)的(de)(de)(de)(de)包被(bei)(bei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體充分結合；洗板后加(jia)入(ru)生物素(su)化(hua)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)人(ren)(ren) IL-5 抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體，該抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體會與板子上(shang)包被(bei)(bei)抗(kang)(kang)(kang)(kang)(kang)體捕獲的(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)(pin) 和樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 發生特(te)異性結合；洗板后加(jia)入(ru)辣根過氧化(hua)物酶(mei)(mei)（HRP）標(biao)記的(de)(de)(de)(de)鏈(lian)霉親和素(su)，生物素(su)與鏈(lian) 霉親和素(su)會發生高強度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)非共(gong)價結合；洗板后加(jia)入(ru)顯色(se)劑(ji)底物 TMB，若反(fan)應(ying)孔中(zhong)樣(yang)品(pin)(pin)存在(zai)不同(tong)濃(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren) IL-5， 則 HRP 會使(shi)無色(se) TMB 變成不同(tong)深淺（正相關(guan)）的(de)(de)(de)(de)藍(lan)色(se)物質，加(jia)入(ru)終(zhong)止液后反(fan)應(ying)孔會變成黃色(se)；后，在(zai) λmax=450 nm（OD=450 nm）處(chu)測定反(fan)應(ying)孔樣(yang)品(pin)(pin)吸光度(du)(du)（OD），樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren) IL-5 濃(nong)度(du)(du)與 OD 成正比，通過 繪制標(biao)準(zhun)(zhun)曲線和四參(can)數擬合軟件便可計(ji)算出樣(yang)本(ben)中(zhong)人(ren)(ren) IL-5 的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度(du)(du)。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5. 為避免(mian)交叉污染，請在試驗中使用 1 次性(xing)試管，槍(qiang)頭，封(feng)板膜(mo)（※）及潔凈(jing)塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jie)果(guo)準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室(shi)安全防護有關管(guan)理規(gui)定執行(xing)。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋(shi)用(yong)聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于(yu)標準品的(de)值，請將樣品做(zuo)適當倍數稀釋(shi)后檢測(ce)，建議正式實(shi)驗(yan)前做(zuo)預實(shi)驗(yan)以確定稀釋(shi)倍數。

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入
37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準(zhun)品(pin)(pin)梯度(du)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)：加入標準(zhun)品(pin)(pin)/樣(yang)本稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液（SR1）1ml凍干標準(zhun)品(pin)(pin)中，靜置15分鐘(zhong)待其*溶解后輕 輕混(hun)勻(濃度(du)為(wei)2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500?1?78?1?76L標準(zhun)品(pin)(pin)/樣(yang)本稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液（SR1），按(an)照以下(xia)濃度(du) 進行(xing)2倍稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)：300（標準(zhun)品(pin)(pin)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液700ul+溶解好(hao)的(de)標準(zhun)品(pin)(pin)原液300ul）、150、75、37.5、18.75、9.375、 4.68、0 pg/ml進行(xing)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)。300pg/ml為(wei)標準(zhun)曲(qu)線(xian)點濃度(du)，標準(zhun)品(pin)(pin)/樣(yang)本稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液（SR1）作為(wei)標準(zhun)曲(qu)線(xian)的(de) 零點（0pg/ml）。復溶過的(de)標準(zhun)品(pin)(pin)原液（2000pg/ml）未用完(wan)的(de)應廢棄或根據(ju)需要按(an)照一(yi)次用量分裝，并 將(jiang)其貯存在-20～-80℃冰箱(xiang)，具體如下(xia)圖。

4. 生物(wu)素化(hua)抗體工作液(ye)：預先計算好試驗所需用量，用檢(jian)測稀釋液(ye)（SR2）將100倍抗體濃縮液(ye)稀釋成1倍

應(ying)用工作液（稀(xi)釋(shi)前充分(fen)混勻），請在(zai)30分(fen)鐘內(nei)加入到反應(ying)孔中(zhong)。

5. 酶(mei)結合物(wu)工(gong)作(zuo)(zuo)液：按每次試(shi)驗所需用(yong)量配制，用(yong)酶(mei)結合物(wu)稀(xi)(xi)釋液（SR3）將100倍濃縮酶(mei)結合物(wu)稀(xi)(xi)釋成(cheng)1 倍應用(yong)工(gong)作(zuo)(zuo)液（稀(xi)(xi)釋前離心），請在30分鐘內使用(yong)。

6. 洗(xi)滌方法： 

自動洗(xi)板(ban)(ban)：甩盡酶(mei)標(biao)板(ban)(ban)孔中液體，在(zai)厚迭吸(xi)(xi)水紙上拍干，注入(ru)洗(xi)滌(di)液為(wei) 300ul/孔,注 與(yu)吸(xi)(xi)出間隔為(wei) 30 秒，洗(xi)板(ban)(ban) 5 次。 

手工洗(xi)板：甩盡酶標(biao)(biao)板孔中液(ye)體，在厚迭(die)(die)吸(xi)水紙(zhi)(zhi)上拍干(gan)，用洗(xi)瓶加入洗(xi)滌液(ye) 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈(jing)酶標(biao)(biao)板孔中液(ye)體，在厚迭(die)(die)的吸(xi)水紙(zhi)(zhi)上拍干(gan)，洗(xi)板 5 次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波(bo)(bo)長測(ce)(ce)(ce)定 OD 值(zhi)。選擇(ze)雙(shuang)波(bo)(bo)長檢測(ce)(ce)(ce)，參(can)考(kao)波(bo)(bo)長為 630 nm。如不(bu)能進行雙(shuang)波(bo)(bo)長檢測(ce)(ce)(ce)，請 用 450 nm 的 OD 測(ce)(ce)(ce)定值(zhi)減去 630 nm 的 OD 測(ce)(ce)(ce)定值(zhi)。

2.計算標準(zhun)品(pin)(pin)、樣品(pin)(pin)的平(ping)均 OD 值：每個標準(zhun)品(pin)(pin)和(he)標本的 OD 值應減去零(ling)孔的 OD 值

3.以標(biao)準(zhun)品濃度(du)為(wei)橫坐(zuo)標(biao)，吸光度(du)OD值為(wei)縱坐(zuo)標(biao)，用軟件繪制標(biao)準(zhun)曲(qu)線，樣品中IL-5含量可通過對應OD 值由標(biao)準(zhun)曲(qu)線換(huan)算出相應的濃度(du)。

4.若標本 OD 值(zhi)高于標準曲線(xian)上限，應做適當稀釋后重新(xin)檢(jian)測(ce)，計算濃度時再乘以(yi)稀釋倍(bei)數。

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人 IL-5 的樣本含量

 

2. 靈敏度：
低可檢測人 IL-5 濃度達 2pg/ml，
20 個零標準(zhun)品濃(nong)度(du) OD 的平均(jun)值(zhi)加上兩(liang)個標準(zhun)差，計算相應的可檢測(ce)濃(nong)度(du)。

3. 特異性：
不與人 IL-3、IL-5 Rα、IL-5 Rβ反應(ying)(ying)，小鼠(shu) IL-5 等反應(ying)(ying)。

4. 重復性：
板(ban)內，板(ban)間(jian)變異系(xi)數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養(yang)上清中加入(ru) 3 個不同濃度水平的人 IL-5，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在(zai)選取(qu)的 4 份健(jian)康人血漿和細胞(bao)培養上(shang)清(qing)中(zhong)加入(ru)高濃(nong)度(du)人 IL-5，在(zai)標準曲線動力學范圍內(nei)進行稀 釋，評(ping)估線性。