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鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是(shi)用(yong)于(yu)純化(hua)(hua)6×His標簽重(zhong)(zhong)(zhong)組蛋(dan)白(bai)(bai)的一(yi)(yi)種純化(hua)(hua)介質(zhi)(zhi)，它是(shi)由(you)6%交聯(lian)的Sepharose耦(ou)連了一(yi)(yi)種四齒(chi)螯(ao)(ao)合(he)(he)劑NTA而(er)得. 它可(ke)(ke)(ke)用(yong)于(yu)在(zai)非變性(xing)或變性(xing)條件下純化(hua)(hua)任何表(biao)達系統表(biao)達的6×His標簽重(zhong)(zhong)(zhong)組蛋(dan)白(bai)(bai)。NTA，含有四個螯(ao)(ao)合(he)(he)區，較一(yi)(yi)般的三(san)齒(chi)螯(ao)(ao)合(he)(he)劑能更(geng)好(hao)的結(jie)合(he)(he)Ni2+。6×His可(ke)(ke)(ke)與(yu)Ni2+螯(ao)(ao)合(he)(he)，從(cong)而(er)使(shi)(shi)His標簽蛋(dan)白(bai)(bai)結(jie)合(he)(he)在(zai)Ni-NTA純化(hua)(hua)介質(zhi)(zhi)上，未結(jie)合(he)(he)的蛋(dan)白(bai)(bai)被洗滌下去(qu)，結(jie)合(he)(he)在(zai)介質(zhi)(zhi)上的蛋(dan)白(bai)(bai)經過一(yi)(yi)定(ding)濃度的咪唑(zuo)或低pH緩沖液的溫和(he)洗脫下來(lai)，從(cong)而(er)得到高純度的目(mu)的蛋(dan)白(bai)(bai)。該(gai)純化(hua)(hua)介質(zhi)(zhi)與(yu)His標簽蛋(dan)白(bai)(bai)具(ju)有*的親(qin)和(he)力(li)，可(ke)(ke)(ke)達5-20 mg/ml。可(ke)(ke)(ke)在(zai)非變性(xing)和(he)變性(xing)條件下純化(hua)(hua)任何表(biao)達系統所(suo)得的His標簽蛋(dan)白(bai)(bai)。純化(hua)(hua)程(cheng)序簡單(dan)，所(suo)得的蛋(dan)白(bai)(bai)純度可(ke)(ke)(ke)高達95％。Ni-NTA可(ke)(ke)(ke)再(zai)生4-6次，重(zhong)(zhong)(zhong)復使(shi)(shi)用(yong)。本產品懸浮液為20％乙醇(chun)，已螯(ao)(ao)合(he)(he)Ni2+。

操作方法：

A. 非變性條件下抽提His標簽蛋白

1) 準備(bei)細胞，接種，誘(you)導表達。收集細胞，置于-70°C或立即進行步驟2操作。

2) 加(jia)入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用(yong)的工作濃度為1 mM現(xian)用(yong)現(xian)加(jia)。

3) 將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮起來(lai)，加入(ru)溶菌(jun)酶，混(hun)勻，冰(bing)上放置30分鐘(zhong)，超聲或勻漿(jiang)破碎細(xi)胞(bao)。該(gai)步驟冰(bing)上操作。

4) 加(jia)入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放(fang)置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上(shang)(shang))，4°C離心15分鐘以上(shang)(shang)。取上(shang)(shang)清(qing)，置于冰上(shang)(shang)備用或-20°C保存。

6) 將(jiang)NTA樹脂裝入合適的層析(xi)柱，層析(xi)用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣(yang)品(pin)加NTA層析柱中，流速在15 ml/h左右，收集(ji)穿透(tou)部分，用SDS/PAGE分析蛋(dan)白的結合情況。

8) 層析用(yong)5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控(kong)制在30 ml/h左(zuo)右。

9) 分別用5倍(bei)NTA體(ti)積(ji)的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗(xi)脫，流速控制在15 ml/h左右，收集洗(xi)脫液，每管(guan)收集一個NTA體(ti)積(ji)。

10) 確(que)定目標蛋(dan)白(bai)質在洗脫液中的(de)(de)(de)分(fen)布(bu)情況。為有(you)效的(de)(de)(de)方(fang)式是SDS-PAGE分(fen)析。也可以(yi)用(yong)Bradford 蛋(dan)白(bai)質測(ce)定試劑盒，快速確(que)定蛋(dan)白(bai)質的(de)(de)(de)含量，然后用(yong)SDS/PAGE分(fen)析蛋(dan)白(bai)質的(de)(de)(de)分(fen)布(bu)。

11)純(chun)化(hua)的(de)目標蛋白(bai)質的(de)保存條件需要根(gen)據蛋白(bai)質的(de)性質和用途確定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為(wei)濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白

1) 準備細(xi)胞(bao)(bao)，接種(zhong)，誘導表達。收(shou)集細(xi)胞(bao)(bao)，置于-70°C或立即進行(xing)步驟2操作。

2) 加(jia)入1/20細胞生長(chang)體(ti)積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現用現加(jia)。

3) 將細胞懸(xuan)浮起來，冰上超聲破(po)碎(sui)細胞，降低粘稠度(du)。

4) 室溫放置30分(fen)鐘(zhong)，間或混勻或用(yong)磁力(li)攪拌(ban)。

5) 12000轉/分（20,000×g以上），4°C離心15分鐘以上。取(qu)上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝(zhuang)入(ru)合適(shi)的層(ceng)析(xi)(xi)柱，層(ceng)析(xi)(xi)用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱(zhu)中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿(chuan)透部(bu)分(fen)，用于SDS/PAGE分(fen)析蛋白質的(de)結合情況(kuang)。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左(zuo)右。

9) 分別用5倍NTA體(ti)積GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗(xi)脫(tuo)，流(liu)速在15 ml/ h左右，收集(ji)洗(xi)脫(tuo)液，每管(guan)收集(ji)一個NTA體(ti)積。

10) 確定(ding)目標蛋(dan)白(bai)(bai)質在洗脫液中的(de)(de)分布(bu)(bu)情況。為有效的(de)(de)方(fang)式是SDS/PAGE分析。也可(ke)以用Bradford 蛋(dan)白(bai)(bai)質測定(ding)試劑盒，快(kuai)速確定(ding)蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)含量(liang)，然后(hou)用SDS/PAGE分析蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)分布(bu)(bu)。

11) 目(mu)標蛋白(bai)質需要進(jin)一步純化需要根據蛋白(bai)質的用途確定(ding)。

12) 純化的目(mu)標蛋白(bai)質(zhi)需要復性(xing)，復性(xing)常用的手(shou)段可(ke)以參考有關手(shou)冊確(que)定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分(fen)別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用(yong)若干次數（3-5次）后，結(jie)(jie)合效(xiao)率有所下降，可(ke)以用(yong)以下方(fang)法再生(sheng)，提高樹脂的使用(yong)壽命和蛋白(bai)質的結(jie)(jie)合效(xiao)率。

NTA樹(shu)(shu)脂(zhi)再(zai)(zai)生(sheng)(sheng)前需要從層析(xi)柱(zhu)下端流干所有溶液(ye)，估計(ji)出NTA的(de)樹(shu)(shu)脂(zhi)體積，按下列次(ci)序將再(zai)(zai)生(sheng)(sheng)試劑加到層析(xi)柱(zhu)里，在等(deng)上(shang)一步再(zai)(zai)生(sheng)(sheng)溶液(ye)流干后，再(zai)(zai)加下一步再(zai)(zai)生(sheng)(sheng)溶解。

用(yong)戶需要(yao)自行準備25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇(chun)(chun)和去(qu)離子(zi)(zi)(zi)水(shui)。 從層(ceng)析柱下端流(liu)干(gan)所(suo)有溶液，用(yong)2倍(bei)(bei)(bei)NTA樹脂體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution I、2倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子(zi)(zi)(zi)水(shui)、3倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution II、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)25%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)50%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)75%乙醇(chun)(chun)、5倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)100%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)75%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)50%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)25%乙醇(chun)(chun)、1倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子(zi)(zi)(zi)水(shui)、5倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)Stripping Solution III、3倍(bei)(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)去(qu)離子(zi)(zi)(zi)水(shui)分別洗(xi)一(yi)遍。

如果(guo)立即使用(yong)(yong)，用(yong)(yong)5倍體積(ji)(ji)的Ni Charging Solution洗，再(zai)用(yong)(yong)10倍體積(ji)(ji)的平衡溶液(ye)（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果(guo)想長期儲存，加入1倍體積(ji)(ji)的20%乙醇，4°C保存，使用(yong)(yong)前用(yong)(yong)5倍體積(ji)(ji)的Ni Charging Solution洗，再(zai)用(yong)(yong)10倍體積(ji)(ji)的平衡溶液(ye)（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）