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凋亡檢測試劑盒AnnexinV Alexa Fluor488/PI

產品簡介(jie)：
細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凋亡(wang)早期(qi)改變(bian)發生在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)表(biao)(biao)面(mian)(mian)，這些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)表(biao)(biao)面(mian)(mian)的改變(bian)之一(yi)是磷脂(zhi)酰(xian)絲氨酸(suan)(PS)從細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)內(nei)(nei)轉(zhuan)移(yi)到(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)外(wai)，使 PS 暴露在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)外(wai)表(biao)(biao)面(mian)(mian)。PS 是一(yi)種帶負電荷的磷脂(zhi)，正常主要存(cun)在(zai)(zai)于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)的內(nei)(nei)面(mian)(mian)，在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)發生凋亡(wang)時細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)上的這種磷脂(zhi)分布的不對稱性(xing)被破壞而(er)使 PS 暴露在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)外(wai)。Annexin V 具有易于結合到(dao)磷脂(zhi)類如 PS 的特(te)性(xing)，對 PS 有高度的親(qin)和性(xing)。因(yin)此，該(gai)蛋白可(ke)充當一(yi)敏(min)感的探針檢(jian)測暴露在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)表(biao)(biao)面(mian)(mian)的 PS。PS 轉(zhuan)移(yi)到(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)外(wai)不是凋亡(wang)所*的，也(ye)可(ke)發生在(zai)(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)壞死中。兩種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)死亡(wang)方式(shi)(shi)間的差別是在(zai)(zai)凋亡(wang)的初始階(jie)段細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)是 完好的，而(er)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)壞死在(zai)(zai)其(qi)早期(qi)階(jie)段細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)的完整性(xing)就破壞了。因(yin)此，可(ke)以采用Annexin V與PI 雙染的方法，通過流式(shi)(shi)檢(jian)測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)早期(qi)凋亡(wang)。

操作步驟:
1、細胞樣品(pin)的準備：
a)對于貼(tie)壁細胞(bao)(bao)：小(xiao)心收集細胞(bao)(bao)培養液到一離心管內(nei)備(bei)用。用不含 EDTA 的胰酶消化細胞(bao)(bao)，細胞(bao)(bao)可以被(bei)輕(qing)輕(qing)
用移液管(guan)或槍頭吹打(da)下來時，加(jia)入前面收集的細胞(bao)培養液，吹打(da)下所有的貼壁細胞(bao)，并輕輕吹散細胞(bao)。再(zai)次
收集(ji)到(dao)離(li)(li)(li)心管內。1000rpm 左右(you)離(li)(li)(li)心 5min，沉淀(dian)細胞。對于(yu)特定的細胞，如(ru)果細胞無法*離(li)(li)(li)心離(li)(li)(li)心管底，
可以(yi)(yi)適當(dang)延長離(li)心時(shi)間或(huo)稍稍加大離(li)心力。小心吸(xi)除上清，可以(yi)(yi)殘留約 50µl 左右的培養(yang)液，以(yi)(yi)避免吸(xi)走細胞。
加入約 1ml 4℃預冷的 PBS，重懸細(xi)胞(bao)，再次離心沉(chen)淀(dian)細(xi)胞(bao)，小心吸除上清；
b)對于(yu)懸浮細(xi)胞(bao)：1000rpm 左(zuo)右離(li)(li)心 5min，沉淀細(xi)胞(bao)。對于(yu)特(te)定的(de)細(xi)胞(bao)，如果細(xi)胞(bao)無法*離(li)(li)心離(li)(li)心
管底(di)，可以適當延(yan)長離心(xin)時間或(huo)稍稍加大離心(xin)力。小心(xin)吸(xi)除上清，可以殘(can)留約 50µl 左右的培養(yang)液，以避(bi)免
吸走細(xi)胞(bao)。加入約 1ml 4℃ 預(yu)冷的(de) PBS，重懸細(xi)胞(bao)，再(zai)次離心沉淀細(xi)胞(bao)，小(xiao)心吸除上(shang)清；
2、用去離(li)子(zi)水(shui)按 1:3 稀釋結合緩(huan)沖液(4ml 4x 結合緩(huan)沖液+12ml 去離(li)子(zi)水(shui))；
3、用(yong) 1x 結合(he)緩沖(chong)液重新懸浮細胞，調節其濃度為 1-5×106/ml；
4、取 100µl 的細胞懸液(ye)于 5ml 流式管(guan)中，加入(ru) 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘；
5、加入(ru) 10µl 20ug/ml 的碘化丙(bing)錠溶(rong)液(ye)(PI)，并加 400µl PBS，立刻進行流式檢測(ce)。
實驗設計：
1、空白管：陰性對照(zhao)組細(xi)胞(bao)，不加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙錠(ding)溶液(PI)。用于調節(jie)電壓(ya)；
2、單染管：陽性對照組(zu)細胞，只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于調節(jie)補償；
3、檢測管：處理(li)的細胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘(dian)化丙錠(ding)溶液(ye)(PI)。用空白管和單染管調(diao)節好(hao)電(dian)壓(ya)補償
后(hou)，獲(huo)得所(suo)需要的流式數(shu)據。
注意事項：
1、Annexin V 是與磷脂(zhi)酰絲氨(an)酸(PS)親和，而 PS 在不同種屬間沒差(cha)異。在正常細胞(bao)中(zhong)，PS 只(zhi)分布在細胞(bao)膜脂(zhi)
質雙層的內側，而(er)在細胞(bao)凋(diao)亡早期，PS 由(you)脂膜內側翻向外側；
2、低濃度胰(yi)酶消化，輕柔吹打貼壁細胞 2～3 次，離(li)心機 4℃1000rpm 5min 離(li)心，處理(li)得當的話，胰(yi)酶造成損
傷可以控制在(zai) 5%以內(nei)，有(you)對照組(zu)的(de)情況下對實驗結果不(bu)會(hui)造成(cheng)明顯(xian)影響。
3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充(chong)分(fen)很難判斷，而且 PI 本身對細胞也是有毒性的(de)，對實驗結果影響會比胰
酶大，不建議這(zhe)樣(yang)做；
4、Annexin V 是(shi)Ca 依賴的(de)蛋白，所以不(bu)能加入 EDTA，防(fang)止 EDTA 螯合了(le) Ca 離(li)子從而影響 Annexin V，進(jin)而影
響(xiang)結(jie)果。
5、用流式檢測凋亡時(shi)，PI 受時(shi)間的(de)影響很大，因標記了 PI 后(hou)會加大細胞毒性(xing)，隨著時(shi)間延長會導(dao)致 PI 的(de)染(ran)
色增加，特別(bie)是檢測早期凋亡時，如果時間(jian)延(yan)長除了(le)會(hui)導致在流式細(xi)胞儀上的細(xi)胞分群差距加大外，誤差會(hui)明顯
加大。一(yi)般 PI 加上后(hou)(hou)立刻(ke)上機，然(ran)后(hou)(hou)在一(yi)個小時內(nei)檢測完成。兩種方法都可(ke)以，但是按照我們操作(zuo)步驟造成
的誤差會更小。

相關文獻：

《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影響因子:2.705 PMID:30446227
 

凋亡檢測試劑盒AnnexinV Alexa Fluor488/PI