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Mouse IL-1β ELISA KIT

目       錄

背景介(jie)紹………………………………………………………………………………

檢測原理(li)………………………………………………………………………………

注(zhu)意事項………………………………………………………………………………

安全提示………………………………………………………………………………

試劑盒(he)組成及儲(chu)存……………………………………………………………………

自備實驗器材…………………………………………………………………………

樣品收(shou)集及儲存(cun)………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測步驟………………………………………………………………………………

結果判(pan)斷………………………………………………………………………………

參數表征………………………………………………………………………………

參考文獻………………………………………………………………………………

常見問(wen)題分析及解決辦法……………………………………………………………

Mouse IL-1β ELISA KIT背景介紹：

    IL-1分(fen)為(wei)IL-1a, IL-1β兩種,IL-1在(zai)不(bu)同(tong)種屬(shu)中有(you)(you)較(jiao)高同(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)。在(zai)氨基酸水平(ping)上(shang)，IL-1α和IL-1β在(zai)不(bu)同(tong)種屬(shu)同(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)分(fen)別為(wei)60％～70％和75％～78％；但在(zai)同(tong)一種屬(shu)中IL-1α與(yu)IL-1β同(tong)源(yuan)(yuan)性(xing)只(zhi)有(you)(you)25％。IL-1β主(zhu)要(yao)由血液中的單核(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和巨(ju)噬細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)產(chan)生 (18), 星形細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，少突神經膠質細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，腎上(shang)腺皮(pi)質細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，NK細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，內皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，角質形成(cheng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，巨(ju)核(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，血小板(ban)，神經元，中性(xing)粒細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，成(cheng)骨細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，許旺細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，滋(zi)養層細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和成(cheng)纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)也(ye)可產(chan)生IL-1β。IL-1具有(you)(you)廣泛(fan)的免疫調節(jie)作用(yong)，并有(you)(you)致熱和介導(dao)炎(yan)癥的作用(yong)。

 Mouse IL-1β ELISA KIT

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試(shi)劑盒采(cai)用基于雙抗(kang)體夾心法(fa)的酶聯免疫(yi)吸(xi)附檢測技術。將(jiang)抗(kang)小鼠IL-1β單克隆抗體包被在(zai)酶(mei)標(biao)(biao)板上；分別(bie)加入梯度稀釋的標(biao)(biao)準品和預稀釋的樣本(ben)，標(biao)(biao)準品和樣本(ben)中的小鼠IL-1β會與(yu)酶標板(ban)上的包被抗(kang)體(ti)充分結(jie)合(he)；洗板(ban)后加入(ru)生(sheng)物素化抗(kang)小鼠IL-1β抗體，該(gai)抗體會與板子上包被抗體捕獲(huo)的標準品(pin)和樣本中的小鼠(shu)IL-1β發(fa)生特異性結合(he)；洗(xi)板(ban)后加(jia)(jia)入辣根(gen)過氧化物(wu)酶（HRP）標記的(de)鏈霉(mei)親(qin)和(he)素，生物(wu)素與鏈霉(mei)親(qin)和(he)素會發(fa)生高強度(du)的(de)非共(gong)價(jia)結合(he)；洗(xi)板(ban)后加(jia)(jia)入顯(xian)色劑底物(wu)TMB，若反應(ying)孔中樣品存在不(bu)同濃度(du)的(de)小鼠IL-1β，則(ze)HRP會使無色TMB變(bian)成不同(tong)深淺（正相關）的藍色物質，加入終(zhong)止液后(hou)反應孔(kong)會變(bian)成黃(huang)色；后(hou)，在(zai)λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔(kong)樣品(pin)吸(xi)光度(du)（OD），樣本中的小鼠(shu)IL-1β濃(nong)度與OD成正(zheng)比，通過繪制標準(zhun)曲線和(he)四參數擬合軟件便可計算出樣(yang)本中小鼠IL-1β的濃度。

原理圖：

注意事項：※※※

1. 試劑盒應在有效期內使用(yong)，請不要使用(yong)過期的試劑。

2. 試劑(ji)盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未(wei)用(yong)完的標準品(pin)，請丟棄(qi)。

3. 試劑(ji)盒使(shi)用前(qian)請在室溫(wen)恢復(fu)30 min，且充分混勻試劑盒里(li)的(de)各(ge)種成份(fen)及制備的樣(yang)品。

4. 在試驗中標準品(pin)和樣本建議作復孔檢測，且(qie)加入試劑的順序(xu)應保持(chi)*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮(suo)生物素化抗體(ti)和濃縮(suo)酶結合物的(de)體(ti)積較少，在(zai)運輸(shu)過程中微量液體(ti)會沾(zhan)到管壁及瓶 

蓋上(shang)，使(shi)用(yong)前請離心處理(li)（5-10 S即可），使(shi)管壁上(shang)的液體集中在管底部，取用(yong)時，請用(yong)移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的          

試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證(zheng)結(jie)果準確(que)，每次檢測均需做標準(zhun)曲線。

安全提示：試(shi)劑盒中的終止液為酸(suan)性溶液，操作人員在(zai)使用(yong)時請(qing)帶上(shang)手套并注意防護；在操作過(guo)程中也要避免試(shi)劑接觸皮膚和(he)眼睛(jing)，如果不慎接觸，請用大(da)量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按(an)國家生物實驗室安全防護有關管理規定執(zhi)行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）

2． 高(gao)精度移(yi)液(ye)器(qi)及一次(ci)性(xing)吸頭(tou)：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗(xi)板(ban)機或洗(xi)瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水(shui)，去離子水(shui)，量筒等

6． 稀釋(shi)用(yong)聚丙烯試管

 樣本收集及儲存：

1. 細胞培養上清：

將(jiang)細胞培養(yang)基移(yi)無菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后(hou)將上清等量(liang)分裝(zhuang)于(yu)(yu)小EP管并(bing)于(yu)(yu)-20℃下(xia)保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清(qing)樣(yang)本：

室(shi)溫(wen)血液自然凝固20 min后，在4℃條(tiao)件下1000×g離(li)心10 min，然后將上清等(deng)量分(fen)裝于(yu)小EP管并于(yu)-20℃下保(bao)存(cun)(cun)（24小時內檢測(ce)可放入2-8℃儲存(cun)(cun)），保(bao)存(cun)(cun)過程(cheng)中如有沉淀(dian)，請再(zai)次(ci)離心，避免反復(fu)凍融。

3. 血漿樣(yang)本：

將全(quan)血收集到含抗血凝劑(ji)的管中，根(gen)據標本的實際要求選擇EDTA，檸檬(meng)酸(suan)鈉或肝素作為(wei)抗凝劑(ji)，混(hun)合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后(hou)將上(shang)清等(deng)量分裝于(yu)小EP管并于(yu)-20℃下保存（24小時(shi)內檢測可放入2-8℃儲存），避免反(fan)復凍融。

※注意：血(xue)(xue)清血(xue)(xue)漿(jiang)樣本避免(mian)使用(yong)溶血(xue)(xue)、高血(xue)(xue)脂樣本，以免(mian)影響檢測結果；如果樣本(ben)中的靶標物(wu)檢測(ce)濃度高于標準品的高值，請將(jiang)樣品做適(shi)當倍數稀釋(shi)后檢測(ce)，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。

試劑準備：

1. 試劑回溫：先在(zai)實驗前(qian)30 min將(jiang)試(shi)劑盒，待測樣本(ben)放置于室(shi)溫下，濃縮(suo)洗滌(di)液如出現結晶，請放入37℃溫浴(yu)直到結晶全部溶(rong)解。

2. 配(pei)制洗滌液(ye)：預先(xian)計算好稀釋后的(de)洗滌液使用體(ti)積(ji)，然后用(yong)雙(shuang)蒸水(shui)或去離(li)子水(shui)將20倍濃縮洗滌液(ye)稀釋成1倍應用液，未用完(wan)的濃縮(suo)洗滌(di)液放入4℃冰(bing)箱(xiang)保存(cun)。

3. 標準品梯度稀(xi)釋：加入(ru)標(biao)準品/樣(yang)本稀(xi)釋(shi)液（SR1）1ml凍(dong)干標準(zhun)品(pin)中，靜置(zhi)15分鐘待(dai)其*溶(rong)解后(hou)輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(濃(nong)度為2000pg/ml)，然后(hou)按照(zhao)以下濃度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進行稀釋(shi)。復溶(rong)過的標準品原液(ye)（2000pg/ml）未(wei)用(yong)完的(de)應廢棄或根據(ju)需要按照一次用(yong)量分(fen)裝，并將(jiang)其貯存在(zai)-20～-80℃冰(bing)箱，具(ju)體如下圖。

4. 生物素化抗體工(gong)作液：預(yu)先(xian)計(ji)算好試驗所需用(yong)量，用(yong)生物(wu)素(su)化抗體(ti)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃(nong)縮(suo)液稀釋成1倍應用工作液（稀釋(shi)前充分混勻），請在30分鐘內加(jia)入到(dao)反應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結(jie)合物(wu)工作液：按每(mei)次試(shi)驗所需用量配制，用酶結(jie)合物(wu)稀釋液（SR3）將100倍濃(nong)縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘(zhong)內使(shi)用。

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方(fang)法(fa)：

l 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭(die)吸水紙上拍(pai)干，注入洗滌液為(wei)300ul/孔(kong),注與(yu)吸出間隔為30秒，洗板5次。

l 手工(gong)洗板：甩盡酶(mei)標(biao)板孔中液體，在厚迭吸(xi)水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔(kong)，靜止30秒后(hou)甩凈酶標(biao)板(ban)孔(kong)中液(ye)體，在厚(hou)迭(die)的吸水(shui)紙上拍(pai)干，洗板(ban)5次。

結果判斷：

1.用(yong)酶標(biao)儀 450 nm 波(bo)長測定(ding) OD 值。選擇(ze)雙波(bo)長檢測，參考波(bo)長為 630 nm。如不能進行雙波(bo)長檢測，請用(yong) 450 nm 的OD測定(ding)值減去630 nm的OD測定值。

2.計(ji)算標準品(pin)、樣品(pin)的平均OD值(zhi)(zhi)：每個標準品(pin)和(he)標本的OD值(zhi)(zhi)應減去零孔的OD值(zhi)(zhi)

3.以標(biao)(biao)準(zhun)品濃度(du)(du)為橫坐(zuo)標(biao)(biao)，吸光度(du)(du)OD值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)標(biao)(biao)，用軟件(jian)繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲線，樣品中(zhong)IL-1β含(han)量(liang)可通(tong)過對應OD值(zhi)由(you)標準曲(qu)線換算(suan)出相應的濃(nong)度。

4.若(ruo)標(biao)(biao)本OD值高(gao)于標(biao)(biao)準曲線上限，應做適(shi)當(dang)稀(xi)釋后重新(xin)檢(jian)測(ce)，計算濃度時(shi)再乘以(yi)稀釋(shi)倍(bei)數。

參數表征：

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考(kao)，應(ying)以當次試驗標準品繪制的(de)標(biao)準曲線計算小鼠IL-1β的樣本含(han)量

2. 靈敏度：

低(di)可檢測小(xiao)鼠IL-1β濃度達15pg/ml，

20個(ge)零標(biao)準(zhun)品濃度OD的平均值加上(shang)兩個(ge)標(biao)準(zhun)差，計(ji)算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：

不(bu)與小鼠IL-1ra 、IL-1α、IL-1 RI、IL-1 RII等反應，豬的(de)IL-1β等反應

4. 重復性：

板(ban)內，板(ban)間變異系數<10%

5. 回收率：

在選(xuan)取的(de)健康小(xiao)鼠(shu)(shu)血漿(jiang)、細胞培(pei)養上清中加(jia)入 3 個不同濃度(du)水平的(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)IL-1β，計算回收率(lv)。

6. 線性稀釋：

分別在(zai)選取的4 份健(jian)康(kang)小鼠血漿和細胞培養上清中加入高濃度小鼠 IL-1β，在標準曲線動力學范圍內(nei)進行稀釋，評估線性。

參考文獻：

1. Oppenheim, J.J. et al. (1986) Immunol. Today 7:45.

2. March, C.J. et al. (1985) Nature 315:641.

3. Thornberry, N.A. et al. (1992) Nature 356:768.

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5. Huang, J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12829.

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10. Giri, J.G. et al. (1994) J. Immunol. 153:5802.

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