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Mouse IL-6 ELISA KIT目       錄

背景介紹………………………………………………………………………………

檢測原理………………………………………………………………………………

注意事項(xiang)………………………………………………………………………………

安全提(ti)示………………………………………………………………………………

試劑盒組成及儲存……………………………………………………………………

自備(bei)實驗(yan)器材…………………………………………………………………………

樣品收集及(ji)儲存………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測(ce)步(bu)驟………………………………………………………………………………

結果判斷………………………………………………………………………………

參數(shu)表征(zheng)………………………………………………………………………………

參(can)考文獻………………………………………………………………………………

常見問題分析及(ji)解決(jue)辦法(fa)……………………………………………………………

Mouse IL-6 ELISA KIT背景介紹：

白細胞介素-6（IL-6）是由纖維母細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、單核/巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、T淋(lin)巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、B淋(lin)巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、上皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、角質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、以及多種瘤細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)所產生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒(du)感染(ran)、雙鏈RNA及c AMP等(deng)，均可(ke)誘導正常細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)產生白介素6。白介素6能夠刺激參與免疫(yi)反應(ying)的(de)(de)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)、分化并提高其功(gong)能(neng)。IL-6由2條糖蛋白鏈組成；1條為(wei)α鏈，分子(zi)量80KD；另1條為(wei)β鏈，分子(zi)量130KD。α鏈缺(que)少胞(bao)內區，只能(neng)以低親合(he)(he)(he)性(xing)(xing)與IL-6結(jie)合(he)(he)(he)，所形(xing)成的(de)(de)復合(he)(he)(he)物(wu)迅即與高親和性(xing)(xing)的(de)(de)β鏈結(jie)合(he)(he)(he)，通過β鏈向細(xi)胞(bao)內傳遞信(xin)息。IL-6主要有以下生物(wu)特性(xing)(xing)：誘導B細胞分化；支持漿細胞瘤(liu)和(he)骨髓瘤增生；誘(you)導IL-2和IL-2受(shou)體(ti)表達；誘(you)導單核細胞(bao)分化；誘(you)導(dao)CTL；增強(qiang)NK細胞活性；誘(you)導(dao)急(ji)性期反應分子并刺(ci)激(ji)肝細胞；誘(you)導(dao)神經元分化(hua)；誘導腎小(xiao)球(qiu)膜細胞生長；誘導角質(zhi)化(hua)細胞生長。

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試劑(ji)盒采(cai)用基于雙抗體(ti)夾心法的酶聯免(mian)疫吸附檢測(ce)技(ji)術。將抗小(xiao)鼠IL-6單克(ke)隆抗體包被在酶標(biao)板上；分別加入梯度稀(xi)釋的標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)和(he)預稀(xi)釋的樣本，標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)和(he)樣本中(zhong)的小鼠IL-6會與酶標板(ban)上(shang)的包(bao)被抗體充分結合；洗(xi)板后加入生(sheng)物素化抗小鼠IL-6抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕(bu)獲的標準品和樣本中的小鼠IL-6發生特(te)異(yi)性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度(du)的非(fei)共價(jia)結合；洗板(ban)后加入顯色劑底物TMB，若(ruo)反應孔中(zhong)樣品存在不(bu)同濃(nong)度的小鼠IL-6，則HRP會(hui)使無(wu)色(se)TMB變(bian)成不同深(shen)淺（正相關）的(de)藍色(se)物質，加入(ru)終止液后(hou)(hou)反應(ying)孔會(hui)變(bian)成黃色(se)；后(hou)(hou)，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(ce)定反(fan)應孔樣品吸光度（OD），樣本中的小(xiao)鼠(shu)IL-6濃度與OD成正比，通過繪制(zhi)標(biao)準曲線和四(si)參數擬合軟(ruan)件便可計算(suan)出樣本中小鼠IL-6的濃度。

注意事項：※※※

1. 試劑(ji)盒應(ying)在有效期(qi)內(nei)使(shi)用，請不要使(shi)用過期(qi)的試劑(ji)。

2. 試劑盒未使(shi)用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用(yong)完的標準(zhun)品，請(qing)丟棄。

3. 試劑盒使用前請在(zai)室溫(wen)恢復30 min，且充分混勻試劑盒(he)里的各種成份及制備的樣品。

4. 在(zai)試驗中標準品和樣本建(jian)議作復孔檢測，且(qie)加入試劑的(de)順序應(ying)保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生(sheng)物素化抗體和(he)濃縮酶結合物的體積較少(shao)，在(zai)運輸過程中微量(liang)液體會(hui)沾到(dao)管壁及瓶(ping) 

蓋上，使(shi)用(yong)前請(qing)離(li)心處(chu)理（5-10 S即(ji)可），使(shi)管壁上的液體集中在管底(di)部，取用(yong)時，請(qing)用(yong)移液器(qi)小心吹打(da)幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結果準(zhun)確(que)，每次檢測均(jun)需做(zuo)標準曲線。

安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員(yuan)在使用時請(qing)帶上手(shou)套并(bing)注意防護；在操作過程中也要避免試劑接(jie)(jie)觸(chu)皮膚和眼睛，如果(guo)不慎接(jie)(jie)觸(chu)，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時(shi)，請按國家生物實驗室安全防護有關管理(li)規定執行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波(bo)長(chang)450nm，參考波(bo)長(chang)630nm）

2． 高精度(du)移液(ye)器及(ji)一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗(xi)板機或洗(xi)瓶(ping)

4． 37℃孵(fu)育箱

5． 雙蒸水(shui)，去離(li)子水(shui)，量筒(tong)等

6． 稀釋用聚丙烯(xi)試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞(bao)培養上清：

將細胞培養基移無菌離心管，在4℃條件(jian)下1000×g離心(xin)10 min,然后(hou)將上清(qing)等(deng)量分裝于小(xiao)EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測(ce)可放入(ru)2-8℃儲存），避免反(fan)復(fu)凍融。

2. 血清樣本(ben)：

室(shi)溫血液(ye)自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心(xin)10 min，然后將上清等(deng)量(liang)分裝于(yu)小(xiao)EP管(guan)并于(yu)-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲(chu)存），保存過程(cheng)中如有沉淀，請(qing)再次(ci)離心，避免反復凍融(rong)。

3. 血(xue)漿(jiang)樣(yang)本：

將全血收集到(dao)含抗血凝(ning)劑(ji)的管中，根(gen)據標本(ben)的實際(ji)要(yao)求選擇EDTA，檸檬酸鈉或(huo)肝素作為抗凝(ning)劑(ji)，混合(he)20 min，在(zai)4℃條件下(xia)1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并(bing)于-20℃下保存(cun)（24小時內(nei)檢測可放(fang)入(ru)2-8℃儲存(cun)），避免(mian)反復(fu)凍融。

※注意：血清血漿樣(yang)本避免使用溶血、高(gao)血脂樣(yang)本，以免影(ying)響(xiang)檢(jian)測結果；如果樣本中的靶標物檢測(ce)濃(nong)度(du)高于(yu)標準品的高值，請將樣品做適當倍數稀(xi)釋(shi)后檢測(ce)，建議正式實(shi)驗(yan)前做預實(shi)驗(yan)以確定稀(xi)釋(shi)倍數。

試劑準備：

1. 試劑回溫：先(xian)在實驗前(qian)30 min將試劑盒，待(dai)測樣(yang)本放置于室溫下，濃縮(suo)洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴(yu)直(zhi)到結晶全(quan)部溶解。

2. 配制洗滌(di)液(ye)：預先計算好稀釋后(hou)的洗滌液使用(yong)體積，然(ran)后(hou)用雙蒸水(shui)或去(qu)離子水(shui)將20倍(bei)濃縮洗(xi)滌液稀釋成1倍應用液，未用完(wan)的濃縮洗(xi)滌液放入4℃冰箱保(bao)存(cun)。

3. 標準品梯度稀釋：加入標(biao)準品(pin)/樣本稀釋液(ye)（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分(fen)鐘待其*溶解后輕(qing)輕(qing)混勻(濃度為1000pg/ml)，用移液(ye)器吸(xi)出(chu)溶(rong)解好的標準(zhun)品原(yuan)液(ye)250ul,加入750ul標準(zhun)品/樣本稀(xi)釋液（SR1）(濃度為250pg/ml)，然(ran)后按(an)照以下濃度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、 0 pg/ml進(jin)行稀釋。復溶過的標準(zhun)品原液（1000pg/ml）未用(yong)完的應(ying)廢棄(qi)或根據(ju)需要按(an)照一次用(yong)量分裝，并將其(qi)貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖(tu)。

4. 生物素化抗體工(gong)作液(ye)：預(yu)先(xian)計(ji)算好試驗(yan)所需用量，用檢測稀釋(shi)液（SR2）將100倍抗體濃(nong)縮(suo)液稀釋成1倍應(ying)用工作液（稀釋前(qian)充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)），請在30分鐘(zhong)內加入到反應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶(mei)結合(he)物(wu)工作液：按每次試驗(yan)所需用(yong)量配(pei)制，用(yong)酶(mei)結合(he)物(wu)稀釋液（SR3）將100倍(bei)濃(nong)縮酶結合(he)物(wu)稀(xi)釋成1倍(bei)應(ying)用工作液（稀釋(shi)前離心），請在30分鐘內(nei)使(shi)用。

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法：

l 自動洗板：甩盡(jin)酶標(biao)板孔中液(ye)體，在(zai)厚迭(die)吸(xi)水紙上拍干(gan)，注入洗滌液(ye)為300ul/孔,注(zhu)與吸出間隔為30秒，洗板5次。

l 手工洗板：甩盡(jin)酶標板孔中(zhong)液體(ti)，在厚迭(die)吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔(kong)，靜止30秒后甩凈酶標板(ban)孔(kong)中液體，在(zai)厚(hou)迭的吸水紙上拍干，洗板(ban)5次(ci)。

結果判斷：

1.用酶標儀(yi) 450 nm 波(bo)長(chang)(chang)測定 OD 值。選擇(ze)雙波(bo)長(chang)(chang)檢測，參考波(bo)長(chang)(chang)為 630 nm。如不能進行雙波(bo)長(chang)(chang)檢測，請用 450 nm 的OD測定值(zhi)減(jian)去630 nm的OD測定值。

2.計(ji)算標(biao)(biao)準品(pin)、樣(yang)品(pin)的平均OD值：每個(ge)標(biao)(biao)準品(pin)和標(biao)(biao)本的OD值應減去零(ling)孔(kong)的OD值

3.以(yi)標(biao)準品濃(nong)度為橫坐(zuo)標(biao)，吸光度OD值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，用軟(ruan)件繪制標(biao)準曲線，樣(yang)品中IL-6含量可通過對應OD值(zhi)由標準曲線換算出(chu)相應的濃度(du)。

4.若(ruo)標本OD值(zhi)高于(yu)標準曲線上限，應(ying)做適當稀(xi)釋后(hou)重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shu)。

參數表征：

1. 數據及標準曲線

本(ben)圖僅供參考，應(ying)以當次試驗標準品繪制的(de)標準曲線計算小鼠IL-6的樣本含量

2. 靈敏度：

低可(ke)檢測小鼠IL-6濃度達2pg/ml，

20個零標(biao)準品濃度OD的平均值加上兩(liang)個標(biao)準差，計算(suan)相(xiang)應(ying)的可(ke)檢測(ce)濃度。

3. 特異性：

不與小(xiao)鼠CT-1、 gp130、 IL-11、 LIF反應，人的IL-6、IL-6 sR 等反應

4. 重復性：

板(ban)內，板(ban)間(jian)變異(yi)系數(shu)<10%

5. 回收率：

在選取的健(jian)康(kang)小鼠血漿、細胞培養上(shang)清中加(jia)入 3 個(ge)不同濃度水平的小鼠 IL-6，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分(fen)別在選取的4 份健康小鼠血(xue)漿和細胞培養上清中加(jia)入高濃度小鼠 IL-6，在標準曲(qu)線動(dong)力學范圍內進行稀(xi)釋，評(ping)估線性。