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PCR純化Kit
貨號：D6492-01
規格：100/盒
品牌：omega

     聚合(he)酶(mei)鏈式(shi)反(fan)應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是(shi)80年代中(zhong)期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有(you)特異、敏感(gan)、產率高、快速、簡便、重(zhong)復(fu)性好、易自動(dong)化等(deng)突出優(you)點；能在(zai)一個試管內(nei)將(jiang)所要研究(jiu)的目的基因或某一DNA片段于數小(xiao)時(shi)內(nei)擴增十萬(wan)(wan)乃(nai)百萬(wan)(wan)倍，使肉眼能直(zhi)接觀察和判斷；可(ke)從(cong)一根毛發、一滴血(xue)、甚一個細胞中(zhong)擴增出足量的DNA供分析研究(jiu)和檢測(ce)鑒定。過(guo)去幾(ji)天幾(ji)星(xing)期才能做到的事(shi)情，用PCR幾(ji)小(xiao)時(shi)便可(ke)完成。PCR技術是(shi)生物醫學領域中(zhong)的一項革命性創舉和里(li)程碑。

    PCR技術的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)本原(yuan)理類似于DNA的(de)(de)(de)(de)(de)天然復制(zhi)(zhi)過程(cheng)，其特異(yi)性(xing)(xing)依賴于與靶(ba)序列兩端(duan)互(hu)補的(de)(de)(de)(de)(de)寡核苷酸引(yin)物。PCR由變(bian)(bian)(bian)性(xing)(xing)→退(tui)火→延伸三個(ge)基(ji)(ji)本反(fan)應步驟構成：①模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)(bian)(bian)性(xing)(xing)：模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA經加熱94℃左(zuo)右一(yi)定時(shi)間后，使模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA雙(shuang)鏈(lian)或經PCR擴增(zeng)(zeng)形(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)鏈(lian)DNA解離，使之(zhi)成為(wei)單鏈(lian)，以便它與引(yin)物結(jie)合(he)，為(wei)下輪反(fan)應作準備；②模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA與引(yin)物的(de)(de)(de)(de)(de)退(tui)火(復性(xing)(xing))：模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA經加熱變(bian)(bian)(bian)性(xing)(xing)成單鏈(lian)后，溫度(du)降55℃左(zuo)右，引(yin)物與模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA單鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)互(hu)補序列配對(dui)結(jie)合(he)；③引(yin)物的(de)(de)(de)(de)(de)延伸：DNA模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)-引(yin)物結(jie)合(he)物在(zai)TaqDNA聚合(he)酶的(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)下，以dNTP為(wei)反(fan)應原(yuan)料，靶(ba)序列為(wei)模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)，按堿基(ji)(ji)配對(dui)與半(ban)保留(liu)(liu)復制(zhi)(zhi)原(yuan)理，合(he)成一(yi)條新的(de)(de)(de)(de)(de)與模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)DNA 鏈(lian)互(hu)補的(de)(de)(de)(de)(de)半(ban)保留(liu)(liu)復制(zhi)(zhi)鏈(lian)。重復循(xun)環(huan)變(bian)(bian)(bian)性(xing)(xing)→退(tui)火→延伸三過程(cheng)，就可獲得更(geng)多的(de)(de)(de)(de)(de)“半(ban)保留(liu)(liu)復制(zhi)(zhi)鏈(lian)”，而(er)且這種(zhong)新鏈(lian)又可成為(wei)下次循(xun)環(huan)的(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)。每(mei)完成一(yi)個(ge)循(xun)環(huan)需 2～4分鐘(zhong)，2～3小(xiao)時(shi)就能將待(dai)擴目的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因擴增(zeng)(zeng)放大幾百萬倍。

PCR反應體系：
    1、引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1～0.5μM，這一引物濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應體系中循環擴增30T。以低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會，但濃度過低則得不到產物或產量過低。

    2、Taq酶：目(mu)前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一(yi)(yi)種是從棲熱水(shui)生桿(gan)菌(jun)中提(ti)純的(de)(de)(de)天然酶，但保真度較差，在復制比(bi)較長的(de)(de)(de)模板時容易發生點突變。另一(yi)(yi)種為在大腸桿(gan)菌(jun)合成(cheng)的(de)(de)(de)基因工程(cheng)酶。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互(hu)補(bu)(bu)原則為基礎，按5’→3’方向逐個(ge)將dNTP分子連接到(dao)引(yin)物(wu)的(de)(de)(de)3’端，合成(cheng)一(yi)(yi)條與(yu)模板DNA互(hu)補(bu)(bu)的(de)(de)(de)新的(de)(de)(de)DNA子鏈。無3’→5’的(de)(de)(de)外(wai)切(qie)酶活性，沒(mei)有校正功能。催化一(yi)(yi)典型的(de)(de)(de)PCR反(fan)應約需酶用量(liang)(liang)一(yi)(yi)般為0.5～5U/100μl，濃度過(guo)高可(ke)引(yin)起非(fei)特異性擴增，濃度過(guo)低則合成(cheng)產物(wu)量(liang)(liang)減少。

    3、dNTP：dNTP的(de)質量(liang)與濃(nong)度(du)和(he)PCR擴增效率有密切關系(xi)。多次(ci)凍融會(hui)使(shi)dNTP降解，一般存儲(chu)濃(nong)度(du)為10mM，小量(liang)分(fen)裝，-20℃冷凍保存。在PCR反(fan)應中，dNTP濃(nong)度(du)一般為50～200μM，尤(you)其(qi)是注意4種(zhong)dNTP的(de)濃(nong)度(du)要相(xiang)等(deng)(等(deng)摩爾配制(zhi))，如其(qi)中任(ren)何一種(zhong)濃(nong)度(du)不(bu)同(tong)于其(qi)它幾種(zhong)時(偏(pian)高或偏(pian)低)，就(jiu)會(hui)引(yin)起錯配。高濃(nong)度(du)dNTP可(ke)加速反(fan)應，但(dan)同(tong)時會(hui)增加錯誤摻入和(he)實驗成(cheng)本；低濃(nong)度(du)dNTP可(ke)提高PCR的(de)性，但(dan)反(fan)應速度(du)和(he)PCR產(chan)物的(de)產(chan)量(liang)會(hui)降低。dNTP能(neng)與Mg 2+ 結合，使(shi)游離的(de)Mg 2+ 濃(nong)度(du)降低。

    4、模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)：就(jiu)模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)而(er)言，影(ying)響(xiang)PCR的(de)主要指模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)的(de)數(shu)量和(he)純度。一(yi)(yi)般PCR反應(ying)中模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)的(de)數(shu)量為10 2 ～10 5 個拷貝(bei)，靈(ling)敏的(de)PCR甚可(ke)從一(yi)(yi)個細胞、一(yi)(yi)根頭發、一(yi)(yi)個孢子或一(yi)(yi)個精子提取的(de)DNA中分析目的(de)序(xu)列(lie)。模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)的(de)純度一(yi)(yi)般要求不(bu)是很高(gao)，某些(xie)擴增實(shi)驗中甚將裂解液直接作為PCR模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)。但模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)中不(bu)能有(you)影(ying)響(xiang)擴增反應(ying)的(de)物(wu)(wu)質存(cun)在(zai)，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉類(lei)物(wu)(wu)質等，上述物(wu)(wu)質的(de)存(cun)在(zai)會影(ying)響(xiang)擴增效果，甚使擴增失敗。模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)DNA的(de)量不(bu)能太高(gao)，否則擴增可(ke)能不(bu)會成功(gong)，在(zai)此情(qing)況(kuang)下(xia)可(ke)適(shi)當稀(xi)釋模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)。一(yi)(yi)般對(dui)于單拷貝(bei)的(de)哺乳動物(wu)(wu)基因組模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)來說，100ul的(de)反應(ying)體系中有(you)100ng的(de)模(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)已足夠。

    5、Mg 2+ ：Mg 2+ 濃度(du)對(dui)PCR擴增的特(te)異(yi)性(xing)和產量有(you)顯著的影響。一般PCR反(fan)應(ying)中，當dNTP濃度(du)為200μM時，Mg 2+ 濃度(du)為1.5～2.0mM為宜。Mg 2+ 濃度(du)過高，反(fan)應(ying)特(te)異(yi)性(xing)降(jiang)低(di)，出現(xian)非特(te)異(yi)擴增，Mg 2+ 濃度(du)過低(di)會降(jiang)低(di)Taq DNA聚合酶(mei)的活性(xing)，使反(fan)應(ying)產物(wu)減少。此外，Mg 2+濃度(du)還影響引物(wu)的退火、模板與(yu)PCR產物(wu)的解鏈溫度(du)、產物(wu)的特(te)異(yi)性(xing)、引物(wu)二(er)聚體的生(sheng)成等。

PCR反應條件：
    1、變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃/min足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物*變性，就會導致PCR失敗。
    2、退火溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
   復性溫度=Tm值－(5～10℃)
   在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60秒，足以使引物與模板之間*結合。
    3、延伸溫度與時間：PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
 ;   4、循環次數：循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40T之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

PCR純化Kit訂(ding)購(gou)說明：

1、絕大部分產品備有現貨，一般情況下都能訂貨當日發貨。 
2、部分非常用產品，需提前1－2日預訂，海外期貨則需要提前3-6周預訂。 
3、部分產品價格會因貨期、批次等因素發生變化，若有變動以訂貨當日新價格為準。 
4、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整，因超過截止時間造成當日不能發貨的將于次日安排發貨。
5、請辦理完貨款后，將收據、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運輸說(shuo)明(ming)：

1、極低溫產品：極低溫產品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
2、低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
3、常溫產品：常溫產品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產品由公司庫房人員快速配貨，準確快速高效的快遞保證產品快速送達您的手中。