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質粒小量提取試劑盒說明書
貨號：D1100
規格：50T/100T
保存：常溫保存，復檢期一年。
試劑盒內容

產品說明：
本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據離心吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA的原理特異性提取質粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。
使用前請先在漂洗液(ye)中加入無水乙醇，加入體積請參照(zhao)瓶體上的標簽。溶液(ye)Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試(shi)劑盒中提(ti)供的 RNaseA 全(quan)部加入），混勻，置(zhi)于 2-8℃保(bao)存。如非指明，所有離心步驟均為(wei)使用臺式離心機在室(shi)溫下離心。

質粒小量提取試劑盒
操作步驟:

1、取1-5ml細菌培養物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入250ul溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質粒受到破壞。
4、向離心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收
集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續的實驗如酶切、PCR等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
10、為(wei)了增加質粒的(de)回收效率，可將(jiang)得到的(de)洗脫液重新加入吸(xi)附柱中，室溫(wen)放置2min，12000rpm離心1min。

注意事項:
1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。
2. 洗脫緩沖液體積不應少于50ul，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調此范圍)， pH值低于7. 0會降低洗脫效率， DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。
3. 如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用5-10ml過ye培養物，同時按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。
4. DNA濃度及純(chun)度檢測：得(de)到的(de)質粒(li)DNA純(chun)度與樣品(pin)保存(cun)(cun)時間、操作過程中的(de)剪切力等因(yin)素有(you)關。得(de)到的(de)DNA可用(yong)瓊脂糖疑膠電泳和紫外分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計檢測濃度與純(chun)度。 DNA應(ying)在(zai)OD260處有(you)顯著吸收(shou)峰(feng)，OD260值(zhi)為(wei)1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA、 40ug/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值(zhi)應(ying)為(wei)1.7-1.9，如果洗脫時不使用(yong)洗脫緩沖(chong)液，而(er)使用(yong)去離子水，比值(zhi)會(hui)偏(pian)低，因(yin)為(wei)pH值(zhi)和離子存(cun)(cun)在(zai)會(hui)影響吸光(guang)(guang)值(zhi)，但并不表(biao)示純(chun)度低。

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