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乙酰輔酶A羧化酶試劑盒 微量法

樣本的前處理

1、細菌或(huo)(huo)培養細胞(bao)：先收集(ji)細菌或(huo)(huo)細胞(bao)到離(li)(li)心(xin)管(guan)內，離(li)(li)心(xin)后棄上(shang)清；按(an)照細菌或(huo)(huo)細胞(bao)數量（104個）：提取液(ye)體積(ji)（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wan)細菌或(huo)(huo)細胞(bao)加入 1mL 提取液(ye)），超聲(sheng)波(bo)破碎(sui)細菌或(huo)(huo)細胞(bao)（冰浴，功率(lv) 20％或(huo)(huo) 200W，超聲(sheng) 3s，間隔(ge) 10s，重(zhong)復 30 次）； 8000g 4℃離(li)(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰上(shang)待測。

2、組(zu)織(zhi)(zhi)：按照組(zu)織(zhi)(zhi)質量（g）：提(ti)取液(ye)體積(ji)(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(cheng)取約 0.1g 組(zu)織(zhi)(zhi)，加入(ru) 1mL 提(ti)取液(ye)），進行冰浴(yu)勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置(zhi)冰上待測。

測定步驟

1、 分光(guang)光(guang)度計(ji)或酶標儀預(yu)熱 30min 以上，調節波(bo)長 660nm，蒸餾水調零。

2、 酶促反應試(shi)(shi)劑(ji)的配制和預熱(re)：在試(shi)(shi)劑(ji)二(er)瓶(ping)中加入(ru) 2.5mL 試(shi)(shi)劑(ji)一(yi)，充分(fen)溶(rong)解混勻；在試(shi)(shi)劑(ji)三瓶(ping)中加入(ru) 2mL 蒸(zheng)餾(liu)水，充分(fen)溶(rong)解混勻；將試(shi)(shi)劑(ji)一(yi)、二(er)、三在 37℃(哺乳動物(wu))或(huo) 25℃ (其它物(wu)種)預熱(re) 10 分(fen)鐘(zhong)。

3、定磷試(shi)劑(ji)(ji)(ji)的(de)配(pei)制：按 H2O: 試(shi)劑(ji)(ji)(ji)四:試(shi)劑(ji)(ji)(ji)五:試(shi)劑(ji)(ji)(ji)六=2:1:1:1 的(de)比例配(pei)制，配(pei)好的(de)定磷試(shi)劑(ji)(ji)(ji) 應為(wei)淺黃色，若(ruo)無色則試(shi)劑(ji)(ji)(ji)失效(xiao)，若(ruo)是藍(lan)色則為(wei)磷污染，定磷劑(ji)(ji)(ji)現用現配(pei)。注意：配(pei)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)用新(xin)的(de)燒(shao)杯、玻棒和(he)玻璃移(yi)液器(qi)，也(ye)可以用一次性(xing)塑料器(qi)皿，避(bi)免磷污染。

4、0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑七 20 倍(bei)稀釋(shi)，即(ji)取 0.5mL 試劑七加 9.5 蒸餾水，充分混勻。

乙酰輔酶A羧化酶試劑盒 微量法

ACC 活(huo)性(xing)計算(suan)(suan)： 1、按組(zu)織(zhi)(zhi)蛋(dan)白濃度(du)(du)計算(suan)(suan)：定(ding)(ding)義：每(mei)(mei)小時(shi)(shi)每(mei)(mei)毫克組(zu)織(zhi)(zhi)蛋(dan)白產生 1μmol 無(wu)(wu)機(ji)磷的(de)量(liang)為一(yi)個(ge) ACC 活(huo)力單位(wei)(wei)。 ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)×V 總(zong))×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan))÷ (V 樣(yang)×Cpr)÷T=10×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan))÷Cpr 2、按樣(yang)本(ben)鮮重計算(suan)(suan)：定(ding)(ding)義：每(mei)(mei)小時(shi)(shi)每(mei)(mei) g 組(zu)織(zhi)(zhi)產生 1μmol 無(wu)(wu)機(ji)磷的(de)量(liang)為一(yi)個(ge) ACC 活(huo)力單位(wei)(wei)。 ACC (μmol/h /g 鮮重)=(C 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)×V 總(zong))×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan)）×V 總(zong)÷ (W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=10×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan))÷W 3、 按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度(du)(du)計算(suan)(suan)：定(ding)(ding)義：每(mei)(mei)小時(shi)(shi)每(mei)(mei) 500 萬細(xi)菌或(huo)細(xi)胞產生 1μmol 無(wu)(wu)機(ji)磷的(de)量(liang)為一(yi)個(ge) ACC 活(huo)力單位(wei)(wei)。 ACC (U/104 cell)=(C 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)×V 總(zong))×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan)）×V 總(zong)÷ (500× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=0.02×(A 測(ce)定(ding)(ding)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 對(dui)照(zhao)管(guan)(guan)(guan)(guan))÷(A 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)-A 空(kong)(kong)(kong)(kong)白管(guan)(guan)(guan)(guan)) C 標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)：標準(zhun)(zhun)管(guan)(guan)(guan)(guan)濃度(du)(du)，0.5μmol/mL；V 總(zong)：酶促反應總(zong)體(ti)積(ji)(ji)，0.1mL；V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本(ben)體(ti)積(ji)(ji)，0.01mL ；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積(ji)(ji)，1mL；T：反應時(shi)(shi)間，0.5 小時(shi)(shi)；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白質濃度(du)(du)，mg/mL；W：樣(yang)本(ben)鮮重，g；500：細(xi)菌或(huo)細(xi)胞總(zong)數，500 萬。

ACC 能夠催(cui)化(hua)乙酰(xian)輔酶 A、NaHCO3和 ATP 生(sheng)成丙二(er)酰(xian)輔酶 A、ATP 和無機磷(lin)，通過鉬酸銨定磷(lin)法測(ce)定無機磷(lin)的增加量來(lai)測(ce)定 ACC 活性。