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羅丹明標記鬼筆環肽 免疫類產品

鬼筆環肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結合，通常用來標記組織切片，細胞培養物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環肽衍生物也以相近的親和力結合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環肽分子的計量比結合。且非特異性結合幾乎可忽略，染色區域和非染色區域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關研究。另外鬼筆環肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發生反應；鬼筆環肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。
鬼筆環肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發生的臨界濃度（CC）降＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品為TRITC（四(si)甲基異硫氰酸羅丹(dan)明）標(biao)記(ji)的(de)(de)鬼(gui)筆環肽(tai)，染色(se)反應特異性(xing)強，對比性(xing)高(gao)，具有比Actin抗體更好的(de)(de)染色(se)效果，適合(he)(he)用作F-actin的(de)(de)定(ding)(ding)性(xing)和定(ding)(ding)量檢(jian)測。另外，經本品結合(he)(he)后的(de)(de)F-actin仍(reng)能維持actin自身具有的(de)(de)許多(duo)生物(wu)學特性(xing)。且本品的(de)(de)結合(he)(he)沒有物(wu)種(zhong)差(cha)異性(xing)，適用性(xing)廣泛。

1. 工作液準備

本品以溶于(yu)甲醇的(de)(de) 20µM 儲存液形式提供，總量為(wei) 300µl。按(an)照 100 nM 的(de)(de)工(gong)作(zuo)液濃度來換算，可制備總量為(wei) 60 ml 的(de)(de)工(gong)作(zuo)液。建議收到產(chan)品后(hou)，根據(ju)單次使用(yong)(yong)量，對(dui)母液進(jin)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wen)定。開始實 驗前，使用(yong)(yong) 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要(yao)的(de)(de)工(gong)作(zuo)濃度。推(tui)薦(jian)工(gong)作(zuo)濃度為(wei)：80~200nM。現(xian)配現(xian)用(yong)(yong)。

2. 染色步驟

1） 細胞(bao)爬(pa)片(pian)生長 24h，使其密度(du)達到(dao) 50%匯合度(du)。

2） 吸掉培養液，37℃預(yu)熱(re)的 1×PBS（pH 7.4）清洗細胞 2 次。

3） 使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液進行(xing)細胞(bao)固(gu)定(ding)(ding)，室溫固(gu)定(ding)(ding) 10min。 注意：避(bi)免固(gu)定(ding)(ding)劑(ji)中含有甲醇(chun)成分，因為甲醇(chun)在固(gu)定(ding)(ding)過(guo)程中可(ke)能破壞肌(ji)動蛋(dan)白。

4） 室溫條(tiao)件下，用 PBS 清(qing)洗細胞 2~3 次(ci)，每次(ci) 10min。

5） 室(shi)溫條件(jian)下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5min。

6） 室溫條件下(xia)，用 PBS 清洗細胞(bao) 2~3 次，每次 10min。

7） 取(qu) 200µl 配(pei)制好(hao)的(de)(de) TRITC 標記鬼筆(bi)環肽工作液，覆蓋(gai)住蓋(gai)玻(bo)片(pian)上的(de)(de)細胞(bao)，室(shi)溫(wen)避光孵(fu)育(yu)(yu) 30min（通(tong)常情況(kuang)下， 4℃~37℃孵(fu)育(yu)(yu)皆可(ke)）。 注(zhu)意(yi)：為了降低背(bei)景，可(ke)于 TRITC 標記的(de)(de)鬼筆(bi)環肽工作液內(nei)加入 1% BSA；另外，孵(fu)育(yu)(yu)過程(cheng)中為了避免溶液揮(hui) 發，可(ke)將蓋(gai)玻(bo)片(pian)轉移(yi)到一(yi)個密(mi)封的(de)(de)容(rong)器內(nei)。

8） 用 PBS 清(qing)洗蓋玻片 3 次，每次 5min。

9） 使用 200µl DAPI 溶液（濃(nong)度：100 nM）對(dui)細胞核進行復(fu)染(ran)，約(yue) 30s。

10) 用 PBS 清(qing)洗蓋玻片(pian)，然(ran)后(hou)倒置在已經滴有一(yi)滴 Fluoromount-GTM 水溶性封(feng)(feng)片(pian)劑的載玻片(pian)上。使(shi)用紙巾輕(qing)輕(qing)檫(cha) 掉多余封(feng)(feng)片(pian)劑，然(ran)后(hou)用指甲油永遠封(feng)(feng)片(pian)。此(ci)法制備的標本(ben)玻片(pian)可置于(yu) 4℃避光保存(cun)，通(tong)常 6 個月(yue)內可繼(ji)續做 F-actin 染色(se)分(fen)析。 注意：也可以直接使(shi)用含有 DAPI 的抗熒(ying)光淬滅封(feng)(feng)片(pian)劑合并步驟(zou)(zou) 9）10），簡化步驟(zou)(zou)。

11) 熒光(guang)(guang)顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jin)行(xing)熒光(guang)(guang)觀察(cha)，選(xuan)擇 TRITC 激發/發射濾片(pian)（Ex/Em=540/570nm）和 DAPI 激 發/發射濾片(pian)（Ex/Em=364/454nm）。

羅丹明標記鬼筆環肽 免疫類產品