蛋白質印跡（Western Blot, WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot），是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開，然后通過電轉移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復制、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結合反應，特殊的抗體標記技術以及相應的檢測方法，進而對目的蛋白進行定性、相對定量檢測的技術。此項技術誕生于上世紀七十年(nian)代，近(jin)半(ban)個(ge)世紀以來經久(jiu)不衰。
WB實驗流程分為樣本采集，蛋白樣品制備，上樣，凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，顯色（信號檢測）。作為一名實驗汪是不是最近又虐到體無完膚？今天來和大家聊聊應用廣泛幾乎人人都曾中槍的Western Blot實驗—樣本采集和蛋白制備的相關知識和技巧。
一、樣本采集和保存
1. 對于動物組織和植物器官，樣(yang)(yang)本較(jiao)多或(huo)取樣(yang)(yang)時間(jian)間(jian)隔太長則需先將樣(yang)(yang)本放入(ru)液(ye)氮速凍(dong)冷存(cun)(cun)；若未能及時進行(xing)蛋白樣(yang)(yang)品制備(bei)，可液(ye)氮速凍(dong)后，存(cun)(cun)入(ru)-80℃保(bao)存(cun)(cun)約(yue)六個月(yue)或(huo)浸(jin)入(ru)液(ye)氮罐保(bao)存(cun)(cun)約(yue)一年。
2. 對于細胞和一些微生物樣本，可去(qu)除(chu)培養(yang)(yang)基后(hou)(hou)，加裂解液(ye)制(zhi)備(bei)蛋白樣品(pin)；若未能及時(shi)制(zhi)備(bei)蛋白樣品(pin)，去(qu)除(chu)培養(yang)(yang)基后(hou)(hou)，將其液(ye)氮(dan)速凍后(hou)(hou)保存于-80℃（約一個月(yue)(yue)）或保存于液(ye)氮(dan)（約三個月(yue)(yue)）。
3. 所有樣本均不建議保存于-20℃。-20℃時，組(zu)(zu)織(zhi)、細胞內的水(shui)會結晶(jing)，細胞活性(xing)和組(zu)(zu)織(zhi)微觀結構會受到傷害，生(sheng)物大分(fen)子受到組(zu)(zu)織(zhi)、細胞內多(duo)種因素的影響(xiang)，穩定性(xing)可能會降低。
二、蛋白提取
一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白，需要準備足夠量的樣本，要求樣本量為細胞>106個，組織>30mg，菌體濕重>10mg，植物>100mg，血清>50µL。蛋白提取的原則：低溫快速，裂解充分。
下面對一些常用樣本的蛋白提(ti)取過程進行簡(jian)單描述(shu)：
1. 細胞樣本
一般樣本為1×106～1×107個細胞，根據細胞量多少或不同細胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，一般1×106個細胞，加裂解(jie)緩沖液(ye)100~200µL，具體實驗操作時參照以上比例，可進行適當調整。
1) 懸浮細胞：收集培(pei)養(yang)(yang)皿或培(pei)養(yang)(yang)瓶中的細(xi)胞，4℃條件(jian)下1000~3000rpm，離心3~5min，留下細(xi)胞沉淀(dian)，去除(chu)細(xi)胞培(pei)養(yang)(yang)基，然后用預冷的0.01M PBS（即1×PBS）輕洗2次，4℃條件(jian)下1000~3000rpm，離心3~5min，去除(chu)上(shang)清，取用細(xi)胞沉淀(dian)，按(an)照上(shang)述(shu)參考比(bi)例加入適量裂解(jie)(jie)緩沖液，吹(chui)打(da)混勻，冰上(shang)裂解(jie)(jie)15~30min。
2) 貼壁細胞：直接去除培養皿或培養瓶中的培養基，用預冷的1×PBS輕洗2次，去除PBS，加入適量裂解緩沖，用細胞刮刮下細胞，連同裂解緩沖液一起收集，吹打混勻，冰上裂解15~30min。或者還有一種方法是直接用細胞刮刮下細胞，連同培養基一起收集，后續過程同懸浮細胞；再有一種方法，是用胰酶消化細胞后，收集細胞，離心沉淀，用預冷的PBS輕洗細胞沉淀，后續過程同懸浮細胞，但胰（蛋白）酶消化的方法不(bu)適用于目的蛋(dan)白為細胞膜(mo)上的膜(mo)蛋(dan)白，會造(zao)成(cheng)影響。
2. 組織(zhi)樣本
一般動物(wu)組織(zhi)樣(yang)本，按照1mg組織(zhi)加(jia)(jia)(jia)(jia)入10µL裂(lie)(lie)解(jie)液的(de)(de)比例(li)進(jin)行添(tian)加(jia)(jia)(jia)(jia)，不同的(de)(de)組織(zhi)蛋白含量也(ye)不同，需要調整添(tian)加(jia)(jia)(jia)(jia)量。去除(chu)組織(zhi)樣(yang)本上(shang)(shang)的(de)(de)脂肪（可用預冷的(de)(de)眼科(ke)剪、鑷子去除(chu)）、血(xue)液（用預冷的(de)(de)PBS清洗）等(deng)(deng)雜(za)質，防(fang)止造成污染，產生干擾。然后(hou)(hou)對處(chu)理(li)好的(de)(de)樣(yang)本，加(jia)(jia)(jia)(jia)入裂(lie)(lie)解(jie)緩沖(chong)液，用預冷的(de)(de)眼科(ke)剪在冰上(shang)(shang)將其剪碎(sui)，可以加(jia)(jia)(jia)(jia)入鋼珠后(hou)(hou)，高速振蕩研磨儀(yi)進(jin)行破碎(sui)。對于骨、肌肉、皮(pi)膚、尾巴、韌帶組織(zhi)等(deng)(deng)或(huo)硬度大或(huo)韌性強(qiang)的(de)(de)樣(yang)本，可以先(xian)試著剪碎(sui)，再進(jin)行液氮研磨后(hou)(hou)加(jia)(jia)(jia)(jia)入適(shi)量裂(lie)(lie)解(jie)液。組織(zhi)樣(yang)本處(chu)理(li)后(hou)(hou)，冰上(shang)(shang)放(fang)置15~30min。
3. 冰上放置裂解的同時，需要加入適量蛋白酶抑制劑來減(jian)少蛋白(bai)(bai)(bai)酶的(de)水(shui)解(jie)作用，磷酸(suan)(suan)化蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)提取(qu)還需要(yao)加入蛋白(bai)(bai)(bai)磷酸(suan)(suan)酶抑(yi)制劑。
4. 冰上放置裂解后，建議再進行超聲處理，經過超聲處理，裂解更充分(fen)。
5. 如有特殊的樣本或者特殊的目的蛋白，常規方法難以提取，建議查閱相關文獻，參照文獻上的配方和步驟提取；若最后未找到相關資料，可購買商品化的試劑盒。
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