產(chan)品名稱(cheng)::線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ活性檢測試劑盒產(chan)品英文名: Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅤActivity Assay Kit產(chan)品貨號:BC1440 產地:北京市通(tong)州區馬駒橋聯東(dong)U谷(gu)8三樓產品(pin)規格:50管/24樣(yang) 產品(pin)商標(biao):solarbio 保存與運輸:4℃保存或-20℃保存; 參考價格:2600 庫存狀態(tai):現(xian)貨 關鍵字(zi):: : : 線(xian)粒體呼(hu)吸鏈復(fu)合(he)體Ⅴ檢測試劑盒| 線粒(li)體呼吸鏈復(fu)合體Ⅴ|線粒體呼吸(xi)鏈|試劑盒
簡要(yao)介紹: 線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)復(fu)合(he)體(ti)(ti)Ⅴ又稱F1F0-ATP合(he)酶(mei),廣泛存在于(yu)(yu)動物、植物、微生物和(he)(he)培(pei)養細(xi)胞的(de)(de)線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)中,由F1和(he)(he)F0兩個亞單位組成(cheng)。該酶(mei)利用呼吸鏈產生的(de)(de)質子電化(hua)(hua)學梯度催化(hua)(hua)ATP合(he)成(cheng),也可(ke)逆過程水(shui)解ATP。此外,復(fu)合(he)體(ti)(ti)Ⅴ還存在于(yu)(yu)葉(xie)綠體(ti)(ti)、異養菌(jun)和(he)(he)光合(he)細(xi)菌(jun)中。復(fu)合(he)體(ti)(ti)Ⅴ是線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)氧化(hua)(hua)磷(lin)酸(suan)化(hua)(hua)和(he)(he)葉(xie)綠體(ti)(ti)光合(he)磷(lin)酸(suan)化(hua)(hua)合(he)成(cheng)ATP的(de)(de)關鍵酶(mei)。 復合體(ti)Ⅴ水解ATP 產生ADP 和Pi,通過(guo)測定(ding)Pi 增加速率來測定(ding)復合體(ti)Ⅴ活性。
產品詳細(xi)描(miao)述(shu) 產品內容: 提取液(ye):液(ye)體15mL×1瓶,4℃保存; 試劑一(yi):液體15mL×1瓶,4℃保存; 試劑二: 粉劑×1支,-20℃保存;臨(lin)用(yong)前每支加入1.11mL雙(shuang)蒸水,充分(fen)溶解備用(yong),分(fen)裝后-20℃保存,避免反復凍融; 試劑三(san):液體6mL×1瓶(ping),4℃保存; 試劑(ji)四:粉(fen)劑(ji)×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL雙(shuang)蒸水,充分混勻; 試劑(ji)五:粉劑(ji)×1瓶(ping),4℃保存;臨(lin)用前加入10mL雙蒸水,充(chong)分混勻; 試劑六:粉劑×1瓶(ping),4℃保存;臨(lin)用(yong)前(qian)加入10mL雙蒸水,充分(fen)混勻(yun); 試劑七:液體10mL×1 瓶,室(shi)溫保(bao)存(cun)。 標(biao)準品:液(ye)體1mL×1 支,4℃保存。10μmol/mL磷標(biao)準液(ye)。臨用(yong)前用(yong)蒸餾水稀釋40倍(bei)即0.25μmol/mL 磷標(biao)準液(ye)。 定磷試(shi)劑(ji)(ji)的配(pei)制(zhi):按(an)H2O:試(shi)劑(ji)(ji)五:試(shi)劑(ji)(ji)六(liu):試(shi)劑(ji)(ji)七=2:1:1:1 的比例配(pei)制(zhi),配(pei)好的定磷試(shi)劑(ji)(ji)應為淺黃色(se)(se)。若無色(se)(se)則試(shi)劑(ji)(ji)失效(xiao),若是藍色(se)(se)則為磷污(wu)染(ran)(請(qing)根據(ju)需要(yao),用多(duo)(duo)少(shao)配(pei)多(duo)(duo)少(shao))。 注意:配試(shi)劑用(yong)新的燒(shao)杯、玻璃(li)(li)棒和玻璃(li)(li)移液器(qi),或(huo)者一次性塑料(liao)器(qi)皿(min),以避免磷污染。 產品(pin)說明: 線(xian)粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合(he)(he)酶(mei)(mei),廣泛(fan)存(cun)在于動物(wu)(wu)、植物(wu)(wu)、微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)和(he)培養細胞的線粒體(ti)(ti)中(zhong),由F1和(he)F0兩個亞單位組成。該酶(mei)(mei)利(li)用(yong)呼(hu)吸鏈產生(sheng)(sheng)的質子電化(hua)學梯度催化(hua)ATP合(he)(he)成,也可逆過程水解ATP。此外,復合(he)(he)體(ti)(ti)Ⅴ還存(cun)在于葉綠(lv)體(ti)(ti)、異養菌(jun)和(he)光合(he)(he)細菌(jun)中(zhong)。復合(he)(he)體(ti)(ti)Ⅴ是(shi)線粒體(ti)(ti)氧化(hua)磷(lin)酸化(hua)和(he)葉綠(lv)體(ti)(ti)光合(he)(he)磷(lin)酸化(hua)合(he)(he)成ATP的關鍵酶(mei)(mei)。 復合(he)體(ti)Ⅴ水解ATP產生(sheng)ADP和Pi,通過測(ce)定Pi增加速率來(lai)測(ce)定復合(he)體(ti)Ⅴ活性。 試驗中所需的儀器和試劑: 臺式(shi)離心機、可見分(fen)光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diao)式(shi)移(yi)液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。 操作步驟: 一、復合(he)體(ti)Ⅴ的提(ti)取(qu): - 稱取約(yue)0.1g組織或收集500萬細胞,加入(ru)1.0 mL提(ti)取液,用冰(bing)浴勻漿器或研(yan)缽勻漿。
- 4 ℃ 600 g離心10min。
- 將上(shang)清液移另一離(li)心管(guan)中,4 ℃ 11000 g離(li)心15min。
- 上清液即胞(bao)漿提取物,可用于測定(ding)從(cong)線(xian)粒體(ti)泄漏的復合體(ti)Ⅳ(此步可(ke)選做,可(ke)以判斷線(xian)粒體提取效(xiao)果(guo))。
- 在沉淀(dian)中加(jia)入(ru)400uL提(ti)取液,超(chao)聲(sheng)波破碎(功率20%,超(chao)聲(sheng)5秒,間隔10秒,重復(fu)15次),用于復(fu)合體Ⅳ酶活(huo)性測定(ding),并且用(yong)于蛋白含量測定(ding)。
二、測定(ding)步驟: - 可見(jian)分(fen)光光度計預熱30min以上(shang),調(diao)節波長660nm,蒸餾水調(diao)零(ling)。
- 操作表(biao):
(1)酶促反應 試劑名稱(μL) | 對(dui)照(zhao)管 | 測定(ding)管 | 標準管(guan) | 試(shi)劑二 | 40 | 40 | - | 試劑三 | 160 | 160 | - | 樣(yang)品 | - | 200 | - | 混勻, 37℃(哺乳動物(wu))或25℃(其它物(wu)種)準確水浴30min | 試劑四 | 80 | 80 | - | 樣品 | 200 | | - | 混勻,8000rpm,室溫離心10min,取(qu)上清(qing)液(ye) |
(2)定(ding)磷(lin) 上清(qing)液 | 200 | 200 | 200 | 定(ding)磷試劑(ji) | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,40℃水浴10min,盡快在(zai)660nm測(ce)定吸光值,分別記為A測(ce)定管(guan)、A對照(zhao)(zhao)管(guan)、A標準(zhun)管(guan),計算ΔA=A測(ce)定管(guan)-A對照(zhao)(zhao)管(guan)。
三、復合體Ⅴ活力單位的(de)計算: 單位的定義(yi):每mg組(zu)織蛋(dan)白在反應體(ti)系中每分鐘產生1 nmol 無(wu)機(ji)磷定義(yi)為一個酶活性(xing)單位。 復(fu)合體Ⅴ活性(U/mg prot)=ΔA÷A標準(zhun)×C標準(zhun)×V酶促×1000÷(Cpr×V樣品)÷T =20×ΔA÷A標準÷Cpr。 C標準液(ye)(ye):標準溶液(ye)(ye)濃度,0.25μmol/mL; 1000:1μmol=1000nmol;Cpr:樣(yang)品(pin)(pin)蛋白濃度,mg/mL,需自行測(ce)定(ding),推薦(jian)我公司BCA蛋白濃度測(ce)定(ding)試劑盒;V樣(yang)品(pin)(pin):樣(yang)品(pin)(pin)體積(ji),0.2mL;V酶促(cu),酶促(cu)反(fan)應(ying)總(zong)體積(ji),0.48mL;T:反(fan)應(ying)時(shi)間,30min。 注意(yi)事項: - 為保證實(shi)驗(yan)結果的(de)準確(que)性,需先取1-2個樣(yang)做預(yu)實(shi)驗(yan),如果測(ce)(ce)定(ding)的(de)吸光(guang)值過高(高于1),可(ke)用蒸餾水稀(xi)釋上清液后再測(ce)(ce)定(ding)。計(ji)算結果時注(zhu)意乘以稀(xi)釋倍數(shu)。若ΔA大于0.4,需將樣(yang)本稀釋(shi)適當(dang)倍數(shu)(計算公式中乘以(yi)相應(ying)稀釋(shi)倍數(shu)),使A1-A2 小于0.2,可(ke)提(ti)高(gao)檢測靈(ling)敏(min)度;若ΔA偏小,則可(ke)以(yi)通過增加加入的樣(yang)品體積來(lai)提(ti)高(gao)靈(ling)敏(min)度。
- 由(you)于(yu)提取(qu)液中含(han)有蛋(dan)白,所以在(zai)測定樣品(pin)蛋(dan)白濃度時需要減(jian)去提取(qu)液本(ben)身的蛋(dan)白含(han)量(單(dan)獨測量)。
- 本試劑盒試劑足夠(gou)完成50管反應。
- 附:使用樣(yang)本重量計算公式:(檢測(ce)樣(yang)本數為50T/24S)
A、上清中復合(he)體(ti)Ⅳ活(huo)力(li)的計算: 按樣本鮮重計算(suan): 單(dan)位定義(yi):每g組織(zhi)在反(fan)應體系中(zhong)每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素(su)C定義(yi)為一個(ge)酶活力單(dan)位。 復合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA1×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA1÷W ΔA1:上(shang)清測定值;V 反總:反應體系總體積,8.4×10-4 L;ε:細胞色素C摩(mo)爾(er)消光(guang)系數,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿(min)光徑(jing),1cm;V 樣(yang):加入樣(yang)本體積,0.04 mL;V提取:加入(ru)提取液體(ti)積(ji),1.0mL。 w:樣(yang)本重(zhong)量,g。T:反應時(shi)間,1 min; B、沉(chen)淀(dian)中復合體Ⅳ活力(li)的計算: 按樣(yang)本鮮重計(ji)算: 單(dan)(dan)位定義(yi)(yi):每(mei)g組織(zhi)在反應體系中每(mei)分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義(yi)(yi)為一個酶活力單(dan)(dan)位。 復合(he)體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總(zong)÷(ε×d)×109]÷(W÷V提(ti)取×V樣(yang))÷T=440×ΔA2÷W ΔA2:沉淀測定值;V 反(fan)總:反(fan)應體系總體積,8.4×10-4 L;ε:細胞(bao)色素C摩(mo)爾消光系數,1.91×104 L / mol /cm;d:比(bi)色皿光徑(jing),1cm;V 樣(yang):加入樣(yang)本體(ti)積,0.04 mL;V提取:加入(ru)提取液體(ti)積,0.4mL。 w:樣本重(zhong)量(liang),g。T:反應時間,1 min; C、樣本復(fu)合體(ti)Ⅳ總活(huo)力(li)的計算: 樣本復合體Ⅳ總活力即為(wei)上清中復合體Ⅳ活力與沉淀中復(fu)合(he)體Ⅳ活力之和(he)。 按樣(yang)本鮮重計算: 復合體Ⅳ(U/g)=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W
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