線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性檢測試劑盒 產品英文(wen)名(ming): Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅣActivity Assay Kit產品貨號:BC0940 產(chan)地:北京市通州區馬駒橋聯東U谷8三樓產品規格:50管/48樣 產品商標:solarbio 保存與運輸:4℃保存或(huo)-20℃保存; 參考(kao)價(jia)格:1900 庫存狀態:現貨(huo) 關鍵字:: : : 線粒(li)體呼吸鏈(lian)復(fu)合體Ⅳ檢測試劑(ji)盒| 線粒體呼吸鏈(lian)復(fu)合(he)體Ⅳ|線粒體呼吸鏈|試劑(ji)盒
簡(jian)要(yao)介(jie)紹: 線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C 氧(yang)(yang)化酶,也是線粒體呼(hu)吸電子(zi)傳遞鏈主路(lu)和支(zhi)路(lu)的共有成分,負(fu)責催化還原型(xing)細胞色素C 的氧(yang)(yang)化,并終把電子(zi)傳遞給(gei)氧(yang)(yang),生成水。 還原型細胞(bao)色(se)素C 在550nm 有特征光吸收(shou),線(xian)(xian)粒體復(fu)合體Ⅳ催化還原型細胞(bao)色(se)素C 生成氧化型細胞(bao)色(se)素C,因此550nm 光吸收(shou)下降速率能夠反映線(xian)(xian)粒體復(fu)合體Ⅳ酶活性。
產品詳細描(miao)述(shu) 產品內容: 提取液:液體80mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液(ye)體(ti)21mL×2瓶,4℃保存(cun); 試(shi)劑(ji)二:粉劑(ji)×2支,-20℃保存; 試劑三:粉劑×2支,4℃保存(cun); 工作液(ye)的配制:臨用前取試(shi)(shi)(shi)劑(ji)一(yi)、試(shi)(shi)(shi)劑(ji)二(er)、試(shi)(shi)(shi)劑(ji)三各一(yi)支,將試(shi)(shi)(shi)劑(ji)二(er)和試(shi)(shi)(shi)劑(ji)三依次轉移到試(shi)(shi)(shi)劑(ji)一(yi)中混合溶解。 產品說明: 線(xian)粒體(ti)復(fu)合(he)體(ti)Ⅳ又稱細(xi)胞(bao)色(se)素(su)C氧(yang)化(hua)酶(mei),也是線(xian)粒體(ti)呼吸電子傳(chuan)(chuan)遞鏈(lian)主(zhu)路(lu)和支路(lu)的共(gong)有成(cheng)(cheng)分,負責催(cui)(cui)化(hua)還原型(xing)(xing)細(xi)胞(bao)色(se)素(su)C的氧(yang)化(hua),并終把電子傳(chuan)(chuan)遞給(gei)氧(yang)生(sheng)成(cheng)(cheng)水。還原型(xing)(xing)細(xi)胞(bao)色(se)素(su)C在550nm有特征光(guang)吸收(shou),線(xian)粒體(ti)復(fu)合(he)體(ti)Ⅳ催(cui)(cui)化(hua)還原型(xing)(xing)細(xi)胞(bao)色(se)素(su)C 生(sheng)成(cheng)(cheng)氧(yang)化(hua)型(xing)(xing)細(xi)胞(bao)色(se)素(su)C,因此550nm光(guang)吸收(shou)下降(jiang)速(su)率(lv)能夠反映線(xian)粒體(ti)復(fu)合(he)體(ti)Ⅳ酶(mei)活性。 試驗中所需的儀器和(he)試劑: 可見(jian)分光光度計(ji)、臺式(shi)離(li)心機、水浴鍋(guo)、可調式(shi)移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操(cao)作步驟: 一(yi)、復(fu)合體Ⅳ的(de)提(ti)取: - 稱取約0.1g組織或(huo)收集(ji)500萬細(xi)胞(bao),加入(ru)1.0 mL提取液,用冰浴勻(yun)漿器或(huo)研(yan)缽勻(yun)漿。
- 4 ℃ 600 g離心10min。
- 將上清液移另一離心管中,4 ℃ 11000 g離心15min。
- 上清(qing)液(ye)即胞漿提取物,可用于(yu)測定從線粒體(ti)泄漏(lou)的復(fu)合(he)體(ti)Ⅳ(此步可(ke)選做,可(ke)以(yi)判(pan)斷線粒體提取(qu)效果)。
- 在沉淀中(zhong)加入400uL提取液,超聲波破碎(sui)(功率20%,超聲5秒,間隔(ge)10秒,重復15次(ci)),用(yong)于(yu)復合體Ⅳ酶活性測定,并(bing)且(qie)用于(yu)蛋白含量測定。
二、測(ce)定步驟(zou): - 可見(jian)分(fen)光光度計預(yu)熱30min 以(yi)上,調節波(bo)長550nm,蒸餾(liu)水調零(ling)。
- 樣本測定
- 將工作(zuo)液置于37℃(哺乳動物(wu))或25℃(其它物(wu)種(zhong))孵育15min;用不完的試劑4℃可保存一(yi)周(zhou);
- 在(zai)1mL玻璃比(bi)色皿中分別加入
試劑名(ming)稱 | 測定管 | 空白 | 樣品(μL) | 40 | - | 蒸餾水(μL) | - | 40 | 工作液(μL) | 800 | 800 |
立(li)即混勻,分別記錄(lu)測定管和空白管550nm處(chu)初(chu)始(shi)吸(xi)光(guang)值(zhi)A1和1min后的吸(xi)光(guang)值(zhi)A2,測定管的(de)記為A1測定管(guan),A2測定管,空(kong)白管的(de)記為A1空(kong)白管,A2空(kong)白(bai)管。計(ji)算ΔA1=A1測定(ding)管(guan)(guan)-A2測定(ding)管(guan)(guan),ΔA2=A1空白管(guan)(guan)-A2空白管(guan)(guan),ΔA=ΔA1-ΔA2。 三、復合體Ⅳ活力單(dan)位的(de)計(ji)算: 單位定義:每mg組(zu)織蛋白(bai)每分鐘催化降解1nmol還(huan)原型細胞(bao)色素C定義為一個酶活力單位。 復合體Ⅳ活力(li)(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr V 反總:反應體系(xi)總體積,8.4×10-4 L;ε:細胞(bao)色素C摩爾消光(guang)系數,1.91×104 L / mol /cm;d:比色(se)皿光徑,1cm;V 樣(yang)(yang):加入樣(yang)(yang)本(ben)體(ti)積,0.04 mL; T:反應時間,1 min;Cpr:樣(yang)(yang)本(ben)蛋白質濃度,mg/mL,需自行測定,建議(yi)使用本(ben)公司BCA蛋白濃度測定試劑盒(he)。 注意(yi)事項: - 為保證實驗結果的(de)(de)準確性,需先取1-2個(ge)樣做預實驗,如果測(ce)定(ding)的(de)(de)吸光值過高(高于1),可用蒸餾(liu)水稀釋(shi)上(shang)清液后再測(ce)定(ding)。計算結果時注(zhu)意乘以稀釋(shi)倍(bei)數。若ΔA大于(yu)0.4,需將(jiang)樣本稀(xi)釋適當倍數(shu)(計算公式中乘以相應稀(xi)釋倍數(shu)),使(shi)A1-A2 小于(yu)0.2,可提高(gao)檢測靈敏度(du);若ΔA偏小,則可以通過(guo)增加加入的(de)樣品體積來(lai)提高(gao)靈敏度(du)。
- 由于提取液(ye)中含有蛋(dan)(dan)白(bai)(bai),所以在測定(ding)樣(yang)品蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)濃(nong)度時需要減去提取液(ye)本身(shen)的蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)含量(單獨測量(liang))。
- 本試劑(ji)(ji)盒試劑(ji)(ji)足夠完成50管反應(ying)。
- 附:使(shi)用樣本(ben)重量計算公式:(檢測樣本(ben)數為50T/24S)
A、上清中復合體(ti)Ⅳ活(huo)力(li)的計算(suan): 按樣本鮮重計(ji)算: 單(dan)位定義:每(mei)g組織在反應體系中每(mei)分鐘催化降解1nmol還原型(xing)細胞(bao)色素(su)C定義為(wei)一個(ge)酶活力單(dan)位。 復合體Ⅳ活(huo)力(li)(U/g)=[ΔA1×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA1÷W ΔA1:上清測定值(zhi);V 反總(zong):反應體系總(zong)體積,8.4×10-4 L;ε:細胞色素(su)C摩(mo)爾消光系數,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積(ji),0.04 mL;V提(ti)取(qu):加(jia)入(ru)提(ti)取(qu)液體(ti)積,1.0mL。 w:樣(yang)本重量,g。T:反應(ying)時間,1 min; B、沉淀中復合體Ⅳ活力的計算: 按樣本鮮(xian)重計算: 單(dan)位(wei)定義:每g組織(zhi)在反應(ying)體系中(zhong)每分鐘催化降解(jie)1nmol還原型細胞色素C定義為一(yi)個酶活(huo)力單(dan)位(wei)。 復合體(ti)Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣(yang))÷T=440×ΔA2÷W ΔA2:沉淀測定值;V 反總:反應體系(xi)總體積,8.4×10-4 L;ε:細胞色素C摩爾(er)消光(guang)系數,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體(ti)積,0.04 mL;V提取:加入(ru)提取液體積,0.4mL。 w:樣本重量(liang),g。T:反應時間,1 min; C、樣本(ben)復合體(ti)Ⅳ總活力的計算(suan): 樣本復合(he)體Ⅳ總活力即(ji)為上清中復合(he)體Ⅳ活力(li)與沉(chen)淀中復合體Ⅳ活(huo)力之和。 按樣本鮮(xian)重計算: 復合體Ⅳ(U/g)=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W
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